响应面法优化构树叶多糖碱提工艺

张晓娜，赵曼，丰亚敏，周海旭

1.新乡工程学院（新乡 453003）；2.河南科技学院（新乡 453003）

构树（Paper mulberry，Broussonetia papyrifera）也称楮树，为桑科构树属多年生阔叶落叶乔木，广泛分布于我国黄河、长江流域[1]。构树病虫害少，在自然环境中的抗逆性强，生长迅速，成活率高[2]。构树叶中维生素、蛋白质、黄酮类、多糖等成分含量丰富[3]，有研究表明构树叶所含的多糖具有预防肿瘤、抗溶血活性、增强免疫力和保护肝脏等重要的生理功能[4-6]。

构树叶主要作为饲料喂养家畜[7]，从构树叶中提取黄酮的研究较多，关于构树叶多糖提取的研究较少，多糖的主要提取方法有水提醇沉法、加热回流提取法和酵母发酵法[8-10]，多糖得率较低，原因可能是多糖与构树叶中的木质素等成分存在共价酯键，多糖较难溶出。在碱性条件下，多糖和木质素等形成的共价酯键容易被破坏，可以增加多糖的溶出量[11]，因此，通常使用碱液来提取麸皮、米糠和叶子中的多糖[12]。选用NaOH溶液提取构树叶中的多糖，并采用响应面分析法对构树叶多糖提取工艺进行优化研究，为构树叶综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

构树叶（2022年11月采自新乡市红旗区）；浓硫酸、苯酚、氢氧化钠、葡萄糖等（均为分析纯）。

1.2 试验仪器与设备

JA5003电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；H1850高速离心机（湘仪离心仪器有限公司）；FW-100高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（常州翔天实验仪器厂）；723N可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）；BXH-65电热鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 构树叶多糖碱提工艺流程

构树叶→洗净烘干（105 ℃，3 h）→粉碎→称量→配制溶液→加入NaOH溶液→水浴→离心（4 200 r/min，10 min）→取上清液→多糖含量测定

1.3.2 构树叶多糖的测定

分别移取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL 0.1 mg/mL葡萄糖标准液至20 mL比色管，用蒸馏水将比色管补至1.0 mL。分别加入1.0 mL 5%苯酚溶液，快速加入5.0 mL浓硫酸，静置10 min，混匀，于30 ℃水浴反应20 min，在波长490 nm处测定吸光度。横坐标为葡萄糖质量浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。线性回归方程为y=0.020 7x-0.035 3（R2=0.993 3），见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

多糖提取液经过离心，吸取上清液，稀释一定倍数后，按照上述操作方法操作，多糖含量以质量分数（W）计，数值以百分率（%）表示，按式（1）计算。

式中：V1为样品定容体积，mL；V2为比色测定时所移取样品测定液体积，mL；m1从标准曲线上查得样品测定液中的含糖量，μg；m2为样品质量，g；n为稀释倍数。

1.3.3 单因素试验

在料液比1︰20 g/mL、碱提时间60 min、碱提温度60 ℃、NaOH溶液浓度0.1 mol/L的基础上进行单因素试验，考察这4个因素对多糖得率的影响。

1.3.4 响应面试验

根据单因素试验结果，综合考虑，利用Box-Behnken设计原理，设计三因素三水平试验，见表1。

表1 因素水平编码表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 料液比对多糖得率的影响

由图2可知，随着溶液量增加，多糖得率逐渐上升，这与提取液量增大溶液黏度会降低，从而使构树叶多糖容易扩散出来有关。溶液量过大，用水量增加，废液浓缩成本会增高。因此，综合考虑多糖提取的整体效益，最适料液比选择1︰30 g/mL。

图2 料液比对多糖得率的影响

2.1.2 碱提时间对多糖得率的影响

由图3可知，多糖得率总体上升，但随着提取时间的变长，多糖大量溶出会导致提取液总黏度增大，由于黏度影响，剩余未溶解的多糖溶解速率会有所下降。因此，考虑到成本和提取效率，综合最适碱提时间选择160 min。

图3 碱提时间对多糖得率的影响

2.1.3 碱提温度对多糖得率的影响

由图4可知，随着温度增高，构树叶多糖得率呈现递增趋势，80 ℃后有所减缓。这可能是因为温度升高后，提取液的黏度变小，分子运动会加快，构树叶多糖更易溶出，但温度过高会破坏多糖结构和造成其生物活性丧失[14]，所以最适提取温度选择80 ℃。

图4 碱提温度对多糖得率的影响

2.1.4 NaOH溶液浓度对多糖得率的影响

由图5可知，NaOH溶液浓度大于0.15 mol/L时，构树叶多糖得率增加缓慢，总体看来，NaOH溶液浓度越高，构树叶多糖的得率也就越大，主要原因可能是NaOH溶液的存在溶解了构树叶的细胞膜，能够促进构树叶多糖的释放[13]，但提高碱液浓度会对多糖结构产生破坏，影响多糖活性，同时碱液浓度高还会造成废液处理难度，提高生产成本。因此，NaOH溶液浓度选取0.10 mol/L。

2.2 响应面试验

由表2可以得到二次多项回归方程：Y=12.77+0.62A+0.62B+0.68C+0.30AB-0.28AC+0.080BC-0.56A2-0.76B2-0.27C2。

表2 响应面的试验设计与结果

2.2.1 建立回归方程及方差分析

由表3可知，该模型P＜0.000 1，极显著，失拟项P为0.470 7，不显著，模型与试验值较符合。R2=0.976 5，表明模型响应值的变化97.65%来自所选变量，未知因数对试验结果影响较小。由F值可见，各因素对多糖得率的影响顺序为NaOH溶液浓度＞料液比＞碱提温度。

表3 回归模型方差分析

2.2.2 响应面交互项解析

料液比、提取温度与NaOH溶液浓度这3个单因素的相互作用对构树叶多糖得率的影响由图6～图8反映。通过Design-Expert 10.0.7软件进行响应面分析得出曲面图存在中心点，存在最佳条件。

图6 料液比与碱提温度对多糖得率影响的等高线和响应曲面

由图6可知，AB交互项等高线呈椭圆且密集，响应曲面坡面陡峭，交互作用显著，说明料液比（A）与碱提温度（B）的交互作用对多糖得率Y影响较大，这与回归模型的交互项预测结果一致。

由图7可知，AC交互项等高线接近椭圆形，曲面坡度陡峭，表明料液比（A）与NaOH溶液浓度（C）的交互作用对多糖得率Y影响显著，但AC等高线密集程度小于AB，所以交互项AC对Y的影响小于交互项AB。

图7 液料比与NaOH溶液浓度对多糖得率影响的等高线和响应曲面

由图8可知，随着碱提温度（B）、NaOH溶液浓度（C）的增加，多糖得率均缓慢上升，这与单因素结果相同，所以碱提温度（B）与NaOH溶液浓度（C）交互作用不显著。

图8 碱提温度与NaOH溶液浓度对多糖得率影响的等高线和响应曲面

综合分析显示各因素对多糖得率的影响存在一定交互作用，AB、AC相互叠加影响显著，BC不显著，影响顺序为AB＞AC＞BC。

2.2.3 验证试验

在Design-Expert 10.0.7软件中对碱提构树叶多糖的拟合进行分析，在提取160 min时，预测的该试验最佳提取工艺为料液比1︰33.408 g/mL、碱提温度88.483℃，NaOH溶液浓度0.117 mol/L，此时，构树叶多糖得率的理论值为13.243%。

为检验所得结果的可靠性，综合考虑成本及现有条件，按照料液比1︰33 g/mL、碱提温度88 ℃、NaOH溶液浓度0.12 mol/L的条件，提取160 min，进行验证试验，同时做平行及空白试验，多糖得率平均值为13.21%，与响应面预测值13.243%非常接近。结果表明，使用该方法优化构树叶多糖碱提工艺的研究有良好的可行性。

3 结论

试验利用碱液提取构树叶多糖，采用响应面法进行优化，对多糖得率的影响顺序为NaOH溶液浓度＞料液比＞碱提温度。根据预测模型，碱提时间以160 min计，最佳提取工艺为料液比1︰33 g/mL、碱提温度88 ℃、NaOH溶液浓度0.12 mol/L。3次验证试验得到的多糖平均得率为13.21%，与响应面理论值13.243%非常接近，说明响应面法对构树叶多糖的碱提工艺条件的优化研究合理且可行。