新型冠状病毒变异株分子诊断的研究现状

杨静远 李永鑫 张新★

截止2022 年11 月，由新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）引发的新冠疫情已导致全球超过6.28 亿人确诊，650 万人死亡［1］。目前世界卫生组织（world health organization，WHO）已经公布了5 种关切变异株（variants of concern，VOCs），分别是B.1.1.7（Alpha）、B.1.351（Beta）、P.1（Gamma）、B.1.6.7.2（Delta）和B.1.1.529（Omicron）［2］。由于SARS-CoV-2属于RNA 病毒，无互补链进行矫正，因此十分容易发生突变［3］。当突变出现在棘突（spoke，S）蛋白受体结合域（receptor binding domain，RBD）中，使得变异株对宿主细胞表面受体血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）的亲和力增加，从而大大提高了病毒的感染能力［4］。鉴于SARS-CoV-2 变异株有着快速的突变频率和超强的传播能力，实现变异株的实时监测对公共卫生预防十分必要。本文主要围绕当前对SARSCoV-2 变异株分子诊断的方法及其基本原理和在SARS-CoV-2 变异株检测中的应用现状进行综述，探讨快速、高效监测病毒突变的技术手段。

1 核酸扩增技术

1.1 实时荧光PCR

实时荧光PCR 检测是确诊新型冠状病毒感染的金标准［5］，但是常规的实时荧光PCR 很难准确地鉴别变异株。目前一些研究者在PCR 基础上进行变异株检测，下面主要介绍常见的几种检测SARS-CoV-2 变异株的PCR 方法。

1.1.1 基于分子信标探针的实时荧光PCR

分子信标（molecular beacon，MB）探针是一段形成发夹结构的寡核苷酸序列，当探针与靶序列相连，淬灭基团与荧光基团远离后发出荧光，使得MB 探针对于点突变的识别有着非常高的特异性。Hadjinicolaou 等［6］通过使用特异识别基因突变位点的MB 探针，对25 例样本进行变异株的检测，结果表明，MB 探针表现出超高的靶向检测能力和特异性。Chrysostomou 等［7］通过MB 探针方法检测了534 例核酸样本，经测序验证该方法具有100%的灵敏度和特异性，表明MB 探针可以准确地检测已知变异株。当出现新的变异株时，需要重新设计MB 探针，因此，该方法在检测未知变异株方面还存在一定的局限性。

1.1.2 基于熔解曲线的实时荧光PCR

熔解曲线是完成扩增反应后逐渐增加温度，荧光信号随温度变化而形成的曲线。由于不同核酸分子的长度以及GC 含量不同，在加热变性时就会有自己的熔解曲线以及特征峰，通过特征峰就能判断扩增产物的特异性。Barua 等［8］应用高分辨率熔融曲线技术鉴定Delta 变异株，试验中Delta阳性样本的熔解温度（melting temperature，Tm）为56.1℃，而非Delta 的Tm 低于52.5℃。因此，Delta与非Delta 的Tm 存在明显差异，可以对Delta 变异株进行区分。Sit 等［9］评估了TIB MOLBIOL 熔融曲线法对S371L/S373P 和E484A 两个突变位点的检测性能，研究显示，该方法对以上两个突变位点检测的灵敏度分别为100%和96.6%，特异性均为100%。基于熔解曲线的实时荧光PCR 可以检测出单个碱基的差异，并且不受检测位点的局限。但熔解曲线易受到扩增产物的影响，当出现非特异性扩增产物时，熔解曲线便会出现杂峰而影响结果的准确性。

1.1.3 基于小沟结合物探针的实时荧光PCR

小沟结合物（minor groove binder，MGB）是一种化学基团，在常用的TaqMan 探针的3'端插入一个MGB，它能够选择性地结合到DNA 螺旋结构中的浅沟，可以增加TaqMan 探针的Tm 值，提高扩增反应的特异性，从而可以有效鉴别点突变。Chan等［10］利用MGB 探针特异检测168 例SARS-CoV-2阳性样本，正确鉴定了34 份样本为N501Y 型突变，其中20 例为B.1.1.7，12 例为B.1.351 以及2 例P.3，其余134 份样本为野生型，该方法的灵敏度和特异性均达到100%。虽然MGB 探针对于点突变检测有着良好的灵敏度和特异性，但是其与MB 探针方法存在共同的局限性，即当出现新的变异株时，需要重新设计探针。

1.1.4 等位基因特异性扩增技术

等位基因特异性扩增技术（allele-specific PCR，AS-PCR）又称扩增阻滞突变系统，是指在扩增过程中只有当引物3`末端的碱基与SNP 位点的等位基因互补配对时，才能正常延伸扩增，由此对扩增产物进行荧光PCR 检测，则可确定突变点位的基因型。Brito-Mutunayagam 等［11］使用AS-PCR体系检测Delta、Alpha 和Beta 的灵敏度分别为99.45%、100%和66.67%，检测三种VOC 的特异性均为100%，并且AS-PCR 检测结果要比全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）快1.3 天。Wang 等［12］利用AS-PCR 对SARS-CoV-2 变异株D614G 和N501Y 的两个突变核酸片段进行选择性扩增，结果提示AS-PCR 对于突变检测有较好的灵敏度和特异性。AS-PCR 是一种简单、准确和经济的检测方法，但是与常规实时荧光PCR 比较，其扩增效率较低，且需要开盖进行产物分析，易造成实验室污染。

1.1.5 其他基于实时荧光PCR 检测平台

自疫情爆发以来，实时荧光PCR 联合其他实验室诊断技术而开发的检测平台已用于SARSCoV-2 变异株检测。Gomez-Martinez 等［13］利用侧流免疫层析法与PCR 中的扩增子形成复合物后进而产生特异的显色条带来检测变异株。该试验选取了9 例SARS-CoV-2 阳性患者的样本，结果均产生了明显和特定的条带信号，同时验证其与实时荧光PCR 符合率为100%。Hernandez 等［14］借助实时荧光PCR/MALDI-TOF-MS 检测平台对60 例SARS-CoV-2 阳性患者的唾液标本进行检测，灵敏度和特异性分为97.14%和100%。综合检测平台在当前变异株检测中能够节约大量的成本，适合区域内大面积筛选。但是这类方法均需将样本直接暴露在实验室当中，加大了实验室污染的风险。

1.2 等温扩增技术

等温扩增技术能在恒定的温度下对核酸进行扩增，与实时荧光PCR 相比，等温扩增技术操作流程更加简单。等温扩增技术包括转录介导扩增（transcription-mediated amplification，TMA）、缺口酶辅助反应（nicking enzyme-assisted reaction，NEAR）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）以及规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）等 技术［15］，本文介绍三种用于SARS-CoV-2 变异株检测的重要技术。

1.2.1 LAMP 技术

LAMP 技术通常使用4～6 对引物，在目的基因上鉴定出6～8 个特定区域，在恒温条件下可以实现高效扩增。LAMP 扩增主要使用内引物和外引物，环引物的加入大大提高了反应速率。Yang 等［16］利用LAMP 技术对84 例Delta 变异株鼻咽拭子标本进行检测，该方法灵敏度和特异性均为100%。Iijima 等［17］利用LAMP 技术对18 例核酸样本（包含5 种呼吸道病毒和4 种呼吸道细菌）进行Delta 的筛选，结果表明，使用该方法仅检测到Delta，所得结果与预期一致。因此，LAMP 技术对于检测SARS-CoV-2 变异株能够展现出较好的特异性。尽管LAMP 反应体系复杂，但操作简单且灵敏度、特异性高，在常规核酸实验室就能够便捷地对SARS-CoV-2 变异株进行检测。

1.2.2 CRISPR 技术

CRISPR 技术是利用CRISPR RNA 特异性结合靶序列，激活Cas 酶进行序列特异性切割，从而实现靶序列核酸的突变检测。Fasching 等［18］利用CRISPR-Cas12 系统对261 例SARS-CoV-2 阳性样本进行点突变识别，同时与WGS 作为对比。结果显示，该方法与WGS 有着98.9%的谱系分类一致性，表明CRISPR-Cas12 系统能够准确识别SARSCoV-2 变异株。Liang 等［19］利用CRISPR-Cas12a 系统对32 例SARS-CoV-2 阳性样本进行点突变检测，检测结果与基因测序的一致性达到了100%。CRISPR-Cas 系统对于基因点突变的识别有着较高的灵敏度和特异性，但CRISPR-Cas 存在脱靶性现象，且反应体系中会有Cas 酶的残留干扰，因此限制了该技术在临床中的应用。

1.2.3 RPA 技术

RPA 技术也称为重组酶介导的扩增技术，是一种利用重组酶、DNA 聚合酶和单链结合蛋白在等温条件下进行核酸扩增的技术，原则上只需要一对引物，恒温下30 分钟内即可提供扩增结果。Li 等［20］在恒温42℃下，25 分钟内对80 例SARSCoV-2 阳性样本检测，结果靶向性和特异性分别为98%和100%。虽然RPA 不需要复杂的引物，且有着快速、简便的操作流程，但是RPA 的反应体系需要多种酶的参与，与LAMP 技术相比体系更复杂，难以在实际工作中得到应用。

2 基因测序技术

基因测序技术是检测SARS-CoV-2 变异株的金标准［15］。测序技术根据发展历程可分为一代测序、二代测序和三代测序，第一代测序技术以Sanger 法为基础，第二代测序技术以高通量为特点，第三代测序技术以纳米孔基因测序技术为主［21］，以上三种技术均可用于SARS-CoV-2 的变异株检测。

2.1 Sanger 测序技术

Sanger 测序是针对含有突变位点的基因序列设计引物，随即进行PCR 扩增后测序。目前已知SARS-CoV-2 主要突变位点集中在S 蛋白的RBD区域，因此扩增子中需确保含有RBD 的重要突变。Ko 等［22］对709 例样本进行了突变筛查，测序结果显示有48 例样本具有特异性突变，其中检测出了单突变、双突变以及三突变，表明Sanger测序适用于SARS-CoV-2 变异株的筛选。Bloemen 等［23］利用Sanger 测序快速检测变异株S 蛋白的突变，结果显示该技术可以区分现有的VOC。同时该研究将Sanger 测序同WGS 比较，Sanger 测序的检测周期更短。Sanger 测序具有成本低、周期短的特点，可用于大规模筛查已出现的变异株。但是Sanger 技术在获取新的变异株全基因组序列数据时，测序周期过长，操作流程繁琐。

2.2 高通量测序技术

高通量测序又称“下一代”测序（next-generation sequencing，NGS），能一次性对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定，目前常用于SARSCoV-2 的全基因组测序，可以为病毒进化和突变提供重要的依据。Coolen 等［24］利用反向补体聚合酶链反应可以在单次PCR 中构建一个Illumina 基因文库，缩短了NGS 技术文库构建的流程，为SARSCoV-2 变异株检测节省了时间和资源。Nasereddin等［25］从SARS-CoV-2 阳性样本的RNA 中扩增出长度为341 bp 的S 基因片段，用NGS 技术对扩增片段进行测序，与WGS 局部变异鉴定对比后其符合率为94.1%。高通量测序不仅能够完成病毒的全基因组测序，还能够通过扩增子进行高效率测序。但NGS 需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，从而限制了其在临床应用中的推广。

2.3 纳米孔基因测序技术

纳米孔基因测序（nanopore sequencing）技术也被称为第三代基因测序，利用检测DNA 碱基通过纳米孔时所产生的特征阻塞电流从而得到核酸的序列信息。Yakovleva 等［26］对收集的103例SARS-CoV-2 基因组进行了局部测序，鉴定出100 例Delta 和3 例Alpha，并分析确定了与这两种VOC 相关的所有氨基酸突变。Wang 等［27］利用该测序技术在6～10 小时得到了SARS-CoV-2 准确的核酸序列，为SARS-CoV-2 的相关毒力基因在病毒传播过程中是否发生了突变提供了有力的证据。虽然第三代测序技术具有速度快、精度高的优势，但是由于技术门槛高，使其很难得到普遍应用。

3 总结与展望

本文所述的分子诊断技术都能在一定程度上起到监测SARS-CoV-2 变异株的作用，目前基因测序技术作为检测SARS-CoV-2 变异株的金标准，但却因仪器设备昂贵，操作专业难度较高，检测周期长等缺点限制了其广泛应用。对于SARS-CoV-2变异株检测新方法的探索旨在开发一种操作简单，并且应对单碱基突变有较高灵敏度的检测技术，解决RNA 病毒变异频率较高，变异株较多的问题，同时满足临床大规模的应用。在此基础上，如何精准、快速的将其与其他呼吸道病毒进行区分检测，也是现行检测技术开发的方向。随着新型分子诊断技术的发展，多技术联合检测的方法学创新以及多学科技术交叉应用，必定能够实现冠状病毒以及其他病原体更加快速、精准、便捷的检测。