电刺激足三里穴增加miR-374 表达促进自噬缓解肝缺血再灌注损伤机制研究

李叶晟，杨宗国，刘 娇，陆云飞，陈 晹，张 猛，陈晓蓉，黄杨卿

肝脏缺血再灌注损伤是肝肿瘤切除、肝移植和外伤等多种外科手术过程中不可避免的病理结果，是导致肝胆外科术后急性肝坏死的主要高危因素，死亡率几乎高达100%。肝缺血再灌注是指中断肝血流和氧气供应一段时间，然后重新恢复血液供应的过程，主要以其导致的肝细胞死亡和组织损伤为特征[1-3]。针灸在我国经过长期的临床实践验证，临床上常用的穴位刺激方法是利用电针对神经、免疫、内分泌等多个系统、器官产生保护作用[4-5]。本课题组前期研究采用神经传导系统和组织结构上非常接近人体的大鼠，选择对应人体三里穴（ST36）的穴位进行电针刺激，结果发现经电刺激足三里穴可有效减轻肝缺血再灌注损伤大鼠的肝脏组织损伤和炎症反应[6]。本研究进一步探索了电刺激缓解损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 32 只6～7 周雄性SD 大鼠（180～220 g）购自上海交通大学药学院，饲养于无特定病原体（SPF）清洁级动物房。抗Beclin-1 抗体（货号3495）、抗LC-3II 抗体（货号12741）和抗β-Actin（货号3700）购自CST。抗大鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α 试剂盒（货号438204）购自Biolegend。逆转录试剂盒（货号RR036A）购自Takara，实时荧光定量PCR 试剂（货号QPK-201）来自TOYOBO。蛋白酶抑制剂购自罗氏。

1.2 大鼠足三里穴定位 大鼠与人体组织结构近，根据大鼠穴位定位图谱选择后三里穴作为靶点穴位，其定位于大鼠膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm 处，左右各一个。

1.3 构建肝脏缺血再灌注模型 将32 只大鼠随机分为4 组：假手术组（NT）、缺血组（IR）、足三里穴电刺激组（IR+EA）、电刺激加miR-374 阻断组（IR+EA+siRNA），每组8 只。SD 大鼠自由进食7 d 后禁食过夜，于次日上午固定大鼠进行足三里穴电针刺激：双后肢进针，深度为7mm，给予强度为4mA、2/100Hz电刺激45 min。尾静脉注射siRNA(金斯瑞合成，序列CAGTTGACCTGAAGCCGAATTCTAA），100 nmol/只。手术建立70%肝脏IR 模型：2.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹正中切口，分离肝门部结构。3 cm 无损伤血管夹阻断肝左横叶及中叶入肝血流，保留右叶及尾叶血供以确保生命体征稳定。腹腔内滴入无菌0.9% 氯化钠溶液1 mL 补充体液，用4-0 号线关腹。将大鼠置于恒温室缺血90 min 后拆线移除血管夹后再次关腹。

1.4 蛋白质免疫印迹实验（Western blot） 检测Beclin-1、LC3 蛋白水平 再灌注8 h 后，取大鼠肝左横叶，分5 份编号后冻存于-80 ℃冰箱待检。裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取肝组织蛋白，加入5×SDS上样缓冲液混匀，于100 ℃煮沸10 min。配制12%SDS PAGE 胶，上样后，110 V 电泳分离，250 mA 将蛋白转印至PVDF 膜，5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，将PVDF 膜与抗体4 ℃过夜孵育，TBST 洗膜后，室温孵育二抗1 h，TBST 洗膜后显影。用Image 分析确定Beclin-1、LC3 蛋白的相对表达量。

1.5 逆转录PCR 和实时荧光定量PCR 检测miR-374 水平 30 mg 肝组织加入1 mL Trizol，组织匀浆后，用氯仿和无水乙醇提取RNA，转录试剂盒获得cDNA，按照说明书配制荧光定量PCR 反应体系。使用的引物见表1。

表1 大鼠定量PCR 引物序列

1.6 检测血清谷丙转氨酶(ALT)水平 所有血清样本各取50 μL 放入0.5 mL 无菌离心管中，送至复旦大学附属上海市公共卫生临床中心实验诊断科，用全自动生化分析仪采用改良赖氏比色法测定样本中的ALT 的含量。

1.7 ELISA 法检测血清TNF-α 水平 在酶标包被板上设标准品孔加，稀释各孔标准品浓度分别至120、80、40、20、10 U/L，设空白孔和待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加稀释液，再加待测样品，用封板膜封板后置于温箱温育。甩干液体，每孔加满洗涤液静置后弃除，重复5 次。每孔加入酶标试剂，空白孔除外，温箱温育1 h。洗涤5 次，依次加入显色剂A、B，避光显色。加终止液终止反应，于450 nm 波长处测量各孔吸光度值。

1.8 苏木精-伊红染色(HE)检测肝脏组织形态 将切好块的肝组织用PBS 清洗去除血渍，投入中性福尔马林固定液30～50 min。通过梯度酒精（50%、70%、80%、95%、100%）进行脱水，后用二甲苯进行透明处理，浸蜡包埋后，将固定修好的石蜡块放在莱卡切片机载物台上，调整石蜡块与刀口的角度、位置，调整切片厚度为6 μm。将切好的石蜡带放置于载破片上，烘干。通过梯度二甲苯、酒精进行脱蜡，将切片放入苏木精中染色10 min，用自来水流水冲洗15 min；再进行梯度酒精脱水，用0.5%伊红乙醇液染色1～3 min，用95%乙醇洗去多余的红色。最后放入无水乙醇、二甲苯I、II、III 各10 min，利用中性树胶封存。20 倍显微镜下观察肝脏组织形态。

2 结果

2.1 电刺激足三里穴可减轻IR 引起的肝脏损伤相关血生化指标 ELISA 结果显示，IR 引起血清ALT表达明显升高，IR+EA 组ALT 升高被抑制（图1A）；IR 引起TNF-α 释放量增加，给予足三里穴电刺激后TNF-α 释放量减少（图1B）。

图1 电刺激足三里穴可减轻IR 引起的肝脏损伤

2.2 电刺激足三里穴可上调IR 大鼠肝脏组织中miR-374 PCR 检测显示，与NT 组相比，IR 组大鼠肝组织miR-374 明显降低；足三里穴电针刺激组（IR+EA）肝组织miR-374 上调（图2）。

图2 电刺激足三里穴可上调IR 大鼠肝脏组织中降低的miR-374

2.3 电刺激足三里穴可增强自噬 Western blot结果显示，与NT 组相比，IR 组LC-3II、Beclin-1蛋白表达显著升高；足三里穴电针刺激组（IR+EA）LC-3II、Beclin-1 较IR 组进一步增加（图3）。

图3 电刺激足三里穴增加肝细胞自噬

2.4 阻断miR-374 减弱IR+EA 诱导的自噬 为了进一步确认miR-374 增强电刺激下的自噬作用，在电刺激处理前尾静脉注射miR-374 siRNA 发现，与IR + EA 组相比，IR+ EA+ siRNA 组大鼠肝组织的miR-374 表达量明显下降（图4A），且LC-3II、Beclin-1 减少，表明自噬活性降低（图4B，4C）。

图4 阻断miR-374 减弱IR+EA 诱导的自噬

2.5 阻断miR-374 加重IR+EA 引起的肝脏损伤IR+ EA+siRNA 组较IR +EA 组血清ALT 和TNF-α含量显著升高，肝脏损伤加重（图5A，5B）。

图5 阻断miR-374 加重IR+EA 引起的肝脏损伤

2.6 大鼠肝脏HE 染色检测组织损伤情况 NT 组肝实质细胞结构正常，无凋亡细胞；IR 组伊红染色的细胞质、细胞外基质信号显著降低，提示细胞的大量凋亡，视野中无完整肝细胞；IR+EA 组肝脏细胞凋亡显著缓解，存在部分完整肝细胞，肝损伤程度最低；IR+ EA+siRNA 组肝损伤比IR +EA 组有加重趋势。见图6。

图6 各组大鼠肝脏病理组织学检查（HE 染色）

3 讨论

肝脏缺血再灌注是肝胆外科手术后常见的高危并发症[7]。缺血导致细胞的急性凋亡、细胞表面糖基化修饰改变及活性氧的产生会继发性诱导补体系统激活、炎症反应等，最终导致更多肝实质细胞继发性凋亡、肝内血管损伤及潜在血栓加剧，导致肝功能迅速降低甚至衰竭。目前临床干预方法主要有缺血预处理，尚无根治疗法。基于靶向抑制损伤相关信号通路的药物，如PI3K 小分子抑制剂、抑制IL-6、TNF-α 的右美托咪，抑制TLR4、NF-κB 信号通路的雷公藤多苷及补体相关C5 单克隆抗体、CTLA4 融合蛋白大多还处于早期研发或机制探索阶段，尚未满足临床需求。因此积极寻找有效安全且经济的新疗法极为重要。

针灸是中医的独特疗法，已有数千年历史。大量文献报道电针刺激对肝脏缺血再灌注有治疗作用，但机制尚未明确。前期研究发现，经针灸治疗慢性萎缩性胃炎的大鼠胃组织中miR-155 和miR-21表达降低，miR-146a 表达升高[8-9]。提示针灸可影响miRNA 的表达。研究团队前期测序数据发现，足三里穴电刺激（EA）的大鼠肝组织miRNA，尤其是miR-374 扩增倍数提高。人的miR-374 家族包括3个成员，分别为miR-374a、miR-374b、miR-374c，有报道miR-374a 通过负调控MAPK6 表达和信号通路活化，保护小鼠免受心肌缺血再灌注损伤[10]。此外也有报道miR-21、miR-20a、miR-146a、miR-199a-3p、miR-214、miR-192、miR-187、miR-805 和miR-194 共9 种microRNA，在小鼠肾缺血再灌注损伤后与对照组相比，表达差异显著，且正式miR-21 可能在保护生小管上皮细胞免于死亡上发挥重要作用[11]。课题组前期测序发现，足三里穴电刺激预处理的大鼠缺血再灌注损伤，肝组织中miR-374 上调最显著。qPCR 进一步验证miR-374 表达在IR 组下降且在8 h 最低，随后表达略有恢复（结果未显示）；在足三里穴电刺激+ IR（EA+IR）组上调。肝损伤标志物ALT 也是在IR 后8 h 出现峰值[6]，miRNA 表达动态变化与肝脏损伤发病进程的一致性，提示miR-374 可能介导足三里穴电刺激对肝脏IR 损伤的保护作用。

科学研究细胞自噬是真核细胞在进化过程中形成的自我保护机制[12]。大量研究发现细胞凋亡过程中会激活细胞自噬，通过清除凋亡细胞的碎片，包括线粒体及过氧化物酶体，进而减少活性氧、降低病灶部位继发性细胞凋亡，改善小鼠肝脏缺血再灌注损伤[13-14]。LC-3 蛋白正常存在于细胞浆，当自噬发生时，LC-3I 会被Atg7、Atg3 调控下进行泛素化修饰，降解一段多肽，产生分子量14KD 的LC-3II。LC-3II 定位在自噬小体上，促进自噬小体与溶酶体融合，最终增加损伤细胞、细胞器的清除。Beclin-1 作为自噬中重要的调控基因，与Bcl-2 相互拮抗来调控自噬。因此LC-3II、Beclin-1 往往被作为细胞自噬的主要标志物[15-16]。

靶向miR-665-3p-ATG4B 自噬轴可缓解肠缺血/再灌注中的炎症和凋亡[17]。但是肝脏中是否存在microRNA，能够像肠缺血模型一样，通过增加自噬缓解组织损伤尚不清楚。本研究回答了上述问题，电针刺激预处理的基础上抑制miR-374 的表达，可观察到自噬明显下降，肝脏损伤加重，证实足三里穴电刺激后增加的miR-374 通过促进适当程度的细胞自噬而保护肝脏损伤。

综上，足三里穴电刺激能增加miR-374 表达，miR-374 促进细胞自噬清除IR 诱导的凋亡肝细胞，有助于控制肝脏炎症，最终缓解缺血再灌注对肝脏的损伤。希望能为针灸未来在临床辅助缓解肝缺血再灌注损伤，提供新的分子佐证和思路。当然该研究也提出一些开放性问题：比如miR374 调控细胞自噬的主要靶点是什么，miR374 是否是肝损伤诱导细胞自噬的唯一上游调控因素，或miR374调控细胞自噬的权重、占比如何？细胞自噬对肝损伤保护作用在多个文献报道，在实际应用中，电刺激足三里穴是否可以部分或者完全替代自噬激动型分子预先给药？以上开发性问题的解答，都能更深入了解针灸与肝损伤缓解之间的内在机制。如果电刺激可以部分替代细胞自噬激活小分子，从电刺激安全性较高的优势，以及小分子在体内系统性暴露带来潜在药物靶向性、安全性不足的劣势分析，都进一步支持针灸在临床中作为辅助疗法应用。