复方沙棘籽油加速大鼠肛周脓肿术后创面修复的作用机制研究

邵书先，王 东，杨关根，裘建明，袁玥旻，何 瑾

肛门直肠周围软组织或其间隙发生急、慢性化脓性感染形成脓肿，称为肛周脓肿，其临床表现为不同程度的肛周局部红肿、灼热、疼痛等[1-2]。目前，肛周脓肿的主要治疗手段为脓肿切开引流术，但术后创面愈合缓慢，伤口疼痛，病程较长，容易形成肛瘘，给患者带来巨大的困扰和压力[3-4]。现代医学认为，创面修复过程存在一个极其复杂的信号网络调控机制，涉及组织、细胞、分子、基因等多个层面，任何一个环节的失控将会导致自身调节的紊乱。研究发现，白细胞介素-8（IL-8）、前列腺素E2（PGE2）对术后创面炎症反应具有调节作用，表皮生长因子（EGF）是目前公认的与创伤愈合关系密切的细胞因子[5]。但其促进肛周脓肿术后创面愈合的效果及作用机制是否与EGF-细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路相关尚不明确。在长期的临床应用中，本研究团队发现复方沙棘籽油对肛周脓肿术后创面有其独特的疗效，可促进创面肉芽组织生长，效果显著，但其具体作用机制目前还没明确。本研究通过建立肛周脓肿大鼠术后创面模型，探讨复方沙棘籽油促进肛周脓肿术后创面愈合的效果及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 65 只SD 大鼠，体质量（180±20）g，在SPF 条件下饲养和实验，经医院动物伦理委员会批准同意。

1.2 主要的药品及试剂 沙棘籽油（甘肃省格瑞斯生物科技有限公司），冰片（浙江华东医药有限公司），EGF、磷酸化ERK1/2 抗体、过氧化物酶标记二抗及即用型SABC 免疫组化试剂盒（中国武汉博士德公司）；检测试剂：抗EGF 抗体（ab217366），抗ERK1+ERK2 抗体（ab17942）。

1.3 实验方法

1.3.1 复方沙棘籽油纳米乳化液制备 低剂量组制备方法：取冰片2.5 g，研细，加入沙棘籽油10 g，搅拌使溶解，再加入乳化剂16 g，搅匀，再加入蒸馏水，边加边搅拌，直至变成黏稠凝胶状，继续加入蒸馏水，使之呈透明或半透明状，并带淡蓝色乳光，最后加蒸馏水至1 000 mL，搅匀，滤过，灌封，于115.5℃灭菌30 min。高剂量组制备方法同上，最后加蒸馏水稀释至500 mL。中剂量组介于二者之间。

1.3.2 动物模型的建立 常规用碘伏消毒大鼠肛周皮肤，将75%冰醋酸0.05 mL 注射于大鼠肛门外周皮下，24 h 后肛门局部形成溃疡，伴有红肿、炎性渗出。参照局部症状四级评分标准（表1）进行评分，4 分以下的大鼠剔出实验。动物模型的建立共选取65 只SD 大鼠进行造模，实验结束按照评分标准，总分值在4 分以上的大鼠共53 只，为保证实验过程中干预措施的均衡性，最终选取50 只模型SD 大鼠进行实验。

1.3.3 实验分组及干预方法 将50 只模型大鼠称重后随机分为5 组。从造模后第1 天开始，各组涂抹相应的实验药物，2 次/d，两次用药间隔4 h，连续14 d。按大鼠与人的体表面积换算关系及中药药理剂量设计1∶2∶4 的方法换算大鼠用药剂量，见表2。

表2 各组给药情况

1.4 观察指标 1）创面愈合率：每天观察创面愈合情况，于术后5、8、14 d 采用透明胶片描记测定局部创面面积，评价记录各组创面动态愈合率。2）术后14 d 创面EGF、ERK1/2 表达情况：应用免疫组化S-P 法、通过MIAS 医学图像分析管理系统分析EGF、ERK1/2 表达情况。3）术后14 d 创面IL-8、PGE2 表达情况：应用上述同样的方法检测各组创面磷酸化IL-8、PGE2 表达水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 进行数据处理与分析，正态分布计量资料用±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5 组大鼠肛周脓肿术后创面愈合率 创面处理后5、8、14 d，5 组大鼠的创面愈合率差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中5 组大鼠创面愈合率由低到高为G1 组＜G2 组＜G3 组＜G4 组＜G5 组，见表3。

表3 5 组大鼠的创面愈合率比较

2.2 5 组大鼠肛周脓肿术后创面组织学变化 HE染色结果提示: 5 组大鼠肛周脓肿术后创面组织表皮生长状态随时间逐步改善，表皮厚度逐渐增加;同一时间点，对照组表皮生长状态最差，表皮厚度最薄; 复方沙棘籽油组术后创面组织表皮厚度明显增加，表皮组织形态明显完善，而复方沙棘籽油高剂量组更甚。术后5、8、14 d，5 组大鼠创面组织HE染色结果见图1。

2.3 5 组大鼠肛周脓肿术后14 d 创面组织中IL-8及PEG2 表达水平的比较 5 组大鼠肛周脓肿术后14 d 创面IL-8 及PEG2 表达水平差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中，大鼠创面IL-8 表达G2组＜G5 组＜G4 组＜G3 组＜G1 组（P＜0.05）；PEG2 表达G5 组＜G2 组＜G4 组＜G3 组＜G1 组（P＜0.05）,见表4，图2、3。

图2 5 组大鼠术后14d 创面组织IL-8 免疫组化表达（×100）

图3 5 组大鼠术后14d 创面组织PEG2 免疫组化表达（×100）

表4 5 组大鼠肛脓肿术后14 d 创面组织IL-8及PEG2 表达水平比较

2.4 5 组大鼠肛周脓肿术后14 d 创面组织EGF 及ERK1/2 表达水平的比较 5 组大鼠肛周脓肿术后14 d 创面EGF 及ERK1/2 表达水平差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中，大鼠肛周脓肿术后创面EGF 及ERK1/2 表达水平G5 组> G4 组> G3 组>G2 组> G1 组（均P＜0.05），见表5，图4、5。

图4 5 组大鼠术后14d 创面组织EGF 免疫组化表达（×100）

图5 5 组大鼠术后14d 创面组织ERK1/2 免疫组化表达（×100）

表5 5 组大鼠肛周脓肿术后14 d 创面组织EGF 及ERK1/2 表达水平比较

3 讨论

肛周脓肿术后创面恢复缓慢、伤口疼痛，病程长。如何加速术后创面修复及减轻痛苦是临床医师最需要解决的难题[6-7]。现代医学研究多侧重于新型高科技抗菌辅料、创面生长因子等，从生物细胞学领域寻求创面修复的突破[8-10]。同时运用外敷药物改善局部微循环并发挥抗菌抗炎作用，以达到术后创面愈合的目的[11-12]。但新型辅料在促进创面愈合及抗炎作用同时并不能减轻伤口疼痛，而创面生长因子也不具备抗炎及减轻疼痛的功效，因此寻求一种药物来促进术后创面修复，同时减轻疼痛，提高愈合质量，成为临床医生及患者共同关注的问题。多项研究表明沙棘籽油含有丰富的维生素A、维生素E、氨基酸、黄酮、多酚等抗氧化成分，为组织重建提供营养物质，同时具有明显的生物活性作用，其抗感染能力强，促进创面愈合快[13-14]。同时本研究也发现冰片有散血止痛功效，能够改善术后疼痛及精神紧张焦虑导致的肛门括约肌痉挛。因此，本研究将两种药物组合成复方沙棘籽油，并通过纳米乳化技术，提高药物渗透、增大药物透皮速率和透皮量，维持恒定血药浓度。本研究结果显示，复方沙棘籽油纳米乳化液治疗组术后创面愈合率高于其余各组，提示复方沙棘籽油对术后创面愈合具有促进作用。免疫组化结果显示，复方沙棘籽油纳米乳化液治疗组大鼠创面组织中表皮生长速率均优于其他组，表明复方沙棘籽油有助于术后创面生长及愈合[15]。

IL-8 可通过结合趋化因子受体IL-8 受体α 和IL-8 受体β 对中性粒细胞产生趋化作用，从而实现对炎症反应的调节作用[16-17]。PGE2 是重要的细胞生长和调节因子，也是重要的疼痛递质，主要作用是扩张血管，同时具有免疫抑制和抗炎作用[18-19]。本研究显示：5 组大鼠术后14 d 创面IL-8 及PEG2 表达水平差异均有统计学意义，说明其可能通过抑制炎症介质释放而改善创面疼痛。同时，EGF 是促进创面愈合的主要影响因素之一，对多种组织来源的上皮细胞有很强的促分裂活性，可促进上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞迁移[20-21]。EGF 还可促进肉芽组织形成，增加肉芽组织中DNA、RNA、蛋白质及胶原合成，可促进血管形成及上皮再生，对皮肤损伤有较好的促愈合作用，是一类对创面修复有重要调控作用的多功能细胞因子。胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族的一员，它的信号传递途径是涉及调节细胞生长、发育及分裂的信号网络的核心，ERK 与EGF 在组织修复中的作用密切相关[22]。本研究显示：5 组大鼠术后14 d 创面EGF 及ERK1/2 表达水平差异均有统计学意义，其中，G5、G4、G3、G2、G1 组大鼠术后创面EGF 及ERK1/2 表达水平依次降低（均P<0.05），说明复方沙棘籽油纳米乳化液具有加速肛周脓肿术后创面修复作用，其可以通过促进创面EGF 的表达→EGF 激活MAPK 途径→ERK 磷酸化→ERK 通路被激活→促进创面角质形成细胞、成纤维细胞生长、增殖、分化→促进创面愈合，此通路通过介导角质形成细胞、成纤维细胞的增殖与迁移活动促进肉芽组织生长，最终可导致迅速上皮化从而使创面愈合[23]。

综上所述，复方沙棘籽油纳米乳化液可能通过IL-8 及PEG2 抑制炎症介质释放，通过EGF-ERK通路的调控达到促进患者术后创面修复的作用，这表明复方沙棘籽油纳米乳化液对肛周脓肿术后创面具有潜在的治疗价值。