银杏叶和柿子叶黄酮类化合物提取条件优化研究

康林芝，侯嘉瑶，唐 辉

（韶关学院 食品学院，广东 韶关 512005）

银杏（Ginkgo bilobaL.）为银杏科、银杏属落叶乔木，有“植物活化石”之称［1］. 多年来，随着人们对银杏的深入了解，开始开发利用银杏资源，其果实白果在药用方面很有价值，也是银杏利用率最高的部分，相比之下银杏叶开发则缺乏力度. 银杏叶是银杏树的干燥叶片，其中最主要的活性物质是黄酮类化合物和萜内酯类化合物［2-3］. 柿子（Diospyros kakiThunb.）在我国有着非常广阔的种植范围，人们都说柿子树“全身都是宝”. 而柿子叶含有许多的黄酮类、鞣质类和酚类等物质［4-6］. 黄酮类化合物具有抗心血管疾病、抗肿瘤、抑菌及抗氧化等多种生理和药理活性，可作为天然有效抑菌剂和抗氧化剂来源，黄酮类化合物的抑菌和抗氧化功效开发，可以为医药、食品和化妆品工业提供丰富的原料，因此应用前景十分广阔［7-11］.

目前，黄酮类化合物提取的方法主要为溶剂提取和热水提取，这两种操作方法简单易行，不需要昂贵设备，是国内外主要采用的方法，但是存在耗费时间长、提取率低的缺点［12］. 提取率低也是黄酮类化合物应用的一大阻碍，因此提高黄酮类化合物的提取率已成为进行黄酮产品开发需要解决的关键问题［13-15］. 超声波法是目前新兴的天然产物提取方法，此方法主要是通过超声波辐射振动促使溶液中产生空化、机械及热效应，从而起到加速溶质的溶解和扩散作用，大大地增大了提取效率［16-17］. 因此，笔者以银杏叶和柿子叶为材料，以黄酮类化合物提取率为指标，利用超声波辅助热水提取黄酮类化合物，用正交试验优化银杏叶和柿子叶黄酮类化合物的提取工艺条件，以期为进一步开发利用银杏叶和柿子叶资源提供参考.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

银杏叶、柿子叶，市售；芦丁标准品（≥98% UV），西安天宝生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇均为分析纯，实验用水为蒸馏水.

1.2 主要仪器与设备

酶标仪MultskanFC，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；超声波清洗机PS-40AL，深圳市华深科工设备有限公司；循环水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）ABS，上海凌科实业发展有限公司；恒温水浴锅HH-S28s，金坛市大地自动化仪器厂；旋转蒸发仪RE-52B，上海雅荣生化仪器设备有限公司；电子分析天平FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；紫外超净工作台SW-CJ-1D，上海精密仪器仪表有限公司；立式压力蒸汽灭菌锅BXM-30R，上海虔钧科学仪器有限公司；恒温培养箱，上海福玛实验设备有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 原材料预处理

把银杏叶和柿子叶洗干净，晒干表面水分后用真空烘箱中烘干，烘干的温度设为50 ℃，烘干时长为5 h.待原料烘干后，用36 000 r·min-1的高速粉碎机将银杏叶和柿子叶粉碎，过0.25 mm（60 目）分样筛，处理好之后，用密封性良好的袋子装好，置于阴凉干燥处，备用.

1.3.2 银杏叶总黄酮提取条件优化单因素试验

采用超声波辅助水提取法对银杏叶中黄酮类化合物进行粗提，将预处理好的银杏叶粉和柿子叶粉分别称取放于各个锥形瓶中，按一定料液比加入蒸馏水，加塞，在60 ℃恒温水浴锅中水浴相应时间，然后放入超声波清洗机控制超声功率超声30 min，接着抽滤收集滤液，将滤液用蒸馏水定容. 以黄酮类化合物提取率为评价标准，选择料液比、水浴时间和超声波功率作为影响黄酮类化合物提取的因素，为正交试验的设计提供依据［18-19］.

1.3.2.1 料液比对提取率的影响

按料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g·mL-1向装有银杏叶粉的锥形瓶加入蒸馏水，放在60 ℃的水浴锅中水浴，控制水浴时间为1.5 h，超声时间为30 min，超声波功率为144 W. 超声结束后抽滤，将滤液定容，在波长510 nm 处测定其吸光度. 结合芦丁标准曲线计算黄酮类化合物的提取率.

按料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45 g·mL-1向装有柿子叶粉的锥形瓶加入蒸馏水，60 ℃下恒温水浴1.5 h，超声30 min，超声波功率为144 W. 抽滤，将滤液定容，测定其吸光度.

1.3.2.2 超声波功率对提取率的影响

取5 个锥形瓶，每个锥形瓶加入银杏叶粉，加入1∶30 g·mL-1的蒸馏水，60 ℃下水浴1.5 h. 分别控制超声波功率为108、126、144、162、188 W. 抽滤后定容，测其吸光度，研究不同超声波功率与银杏叶黄酮类化合物提取率的关系.

称柿子叶粉于5 个锥形瓶中，按料液比1∶30 g·mL-1加入蒸馏水，在60 ℃下恒温水浴1.5 h，分别控制超声波功率为108、126、144、162、188 W. 抽滤后将滤液定容，测定其吸光度，研究不同超声波功率与柿子叶黄酮类化合物提取率的关系.

1.3.2.3 水浴时间对提取率的影响

取4 个锥形瓶，每个锥形瓶加入银杏叶粉，加入料液比为1∶30 g·mL-1的蒸馏水，在60 ℃下恒温水浴，水浴时间为0.5、1.0、1.5、2.0 h，超声波功率为144 W. 超声结束后过滤，将滤液定容，在510 nm 处测定其吸光度，研究水浴时间对银杏叶黄酮类化合物提取率影响.

取4 个锥形瓶，加入柿子叶粉，加入料液比为1∶30 g·mL-1的蒸馏水，在60 ℃下恒温水浴，分别控制水浴时间为1.0、1.5、2.0、2.5 h，超声波功率为144 W. 超声结束后过滤，将滤液定容，测定其吸光度，研究水浴时间对柿子叶黄酮类化合物提取率影响.

1.3.3 正交试验

根据单因素试验结果进行正交试验，以黄酮类化合物提取率为指标，优选出银杏叶和柿子叶中黄酮类化合物提取的最佳料液比、超声功波率及水浴时间. 采用L9（34）正交表设计试验，因素水平见表1 和表2.

表1 银杏叶正交试验因素水平

表2 柿子叶正交试验因素水平

1.3.4 标准曲线的回归方程

参照文献［20-22］绘制芦丁标准曲线，得到浓度c与吸光度Α的线性回归方程为：Α=9.8214c+0.0404，相关系数R2=0.9994.

1.3.5 黄酮类化合物的测定及计算

移取银杏叶及柿子叶的待测样液各3 mL，放入10 mL 具塞比色管，按照标准曲线绘制的方法，先后加入5 mL 60%乙醇溶液、0.3 mL 5 %NaNO2溶液、0.3 mL 10 %Al（NO3）3溶液和4 mL 4 %NaOH 溶液，在波长510 nm 处测定吸光度，依照标准曲线的线性回归方程计算出黄酮类化合物浓度，再根据以下公式计算出各待测样液黄酮类化合物的提取率［16］：提取率（%）= （c×V1×V）/（V2×1 000×m）×100 %. 式中：c为待测样液黄酮类化合物浓度，mg·mL-1；V为所得提取液的总体积，mL；V1为测试定容的体积，mL；V2为从提取液中量取进行测试定容的体积，mL；m为样品粉末质量，g.

2 结果与分析

2.1 银杏叶的单因素试验

2.1.1 料液比对银杏叶黄酮类化合物提取率的影响

如图1 所示，随着溶剂量的增加，提取率先上升后下降. 溶剂量较少时，样液相对较稠，不利于超声波的空化作用，导致超声效果弱化，随着溶剂量的增加，使黄酮类化合物分子传质到溶液中的总量增多，也增强了超声波的效果，所以，在料液比1∶20 到1∶30 之间，提取率上升并达到最大值. 料液比1∶30 后，黄酮类化合物浸出量反而有所下降，可能是由于继续增加溶剂导致银杏叶内杂质浸出，影响了黄酮类化合物的浸出，抑或是溶剂量过多影响了超声波的机械学和热力学作用［13，18］.

图1 料液比对银杏叶黄酮类化合物提取率的影响

2.1.2 超声波功率对银杏叶黄酮类化合物提取率的影响

超声波功率过低，超声波的空化作用和机械效应较弱，使黄酮类化合物提取不完全，当超声波功率过高时，黄酮类化合物的渗出会受到阻碍，甚至会由于空化效应太过强烈而破坏黄酮类化合物的结构使得提取率下降［18］，因此选择合适的超声波功率对于物质的提取有着重要意义. 根据图2 可知，提取率随超声波功率的上升先上升后下降，在108 W 到144 W 之间，提取率处于上升阶段，在144 W 时，黄酮类化合物的提取率达到最大值，在此之后提取率则开始下降.

图2 超声波功率对银杏叶黄酮类化合物提取率的影响

2.1.3 水浴时间对银杏叶黄酮类化合物提取率的影响

如图3 所示，银杏叶的提取率在0.5~1.0 h 时先随水浴时间的增加而上升，在1.0 h 时达到最大值. 在此阶段，提取时间的增加使得银杏叶粉内的物质向溶液中扩散的机率增大，因而提取率上升. 在此之后，则表现为随着时间的上升提取率下降，原因是长时间的提取使得黄酮结构遭到破坏，或是银杏叶内部的杂质溶出，与黄酮类化合物发生反应，破坏了其结构，导致吸光度降低，从而造成提取率降低［19］，由此可见，银杏叶的最佳的水浴时间为1.0 h.

图3 水浴时间对银杏叶黄酮类化合物提取率的影响

研究在前期预试验过程中发现，水浴时间达到一定值后，后续进行超声提取时，超声时间大于30 min则提取效率无明显变化，因此，本试验中银杏叶和柿子叶总黄酮提取中未将超声时间设置为单因素.

2.2 柿子叶的单因素试验

2.2.1 料液比对柿子叶黄酮类化合物提取率的影响

料液比与柿子叶中黄酮类化合物提取率的变化关系如图4 所示. 在1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 和1∶45 这5 个料液比之间，提取率呈先上升后下降的变化. 在1∶35 之前，溶剂量较低，黏度较大，阻碍了超声波的空化作用，影响有效成分的浸出. 在料液比为1∶35 时，柿子叶中的黄酮类化合物提取率提取效果最好. 在此之后，可能是由于继续增加溶剂导致柿子叶内杂质浸出，抑或是溶剂量过多影响了超声波的机械学和热力学作用，造成了提取率下降的现象.

图4 料液比对柿子叶黄酮类化合物提取率的影响

2.2.2 超声波功率对柿子叶黄酮类化合物提取率的影响

超声波功率与柿子叶中黄酮类化合物提取率的变化关系如图5 所示，在这5 个超声波功率之间，提取率随超声波功率的上升先上升，到达126 W 之后，柿子叶的黄酮类化合物提取率有较明显的下降，之后趋于稳定. 超声波功率比较低时，超声波的空化作用和机械效应较弱，使提取物浸出不完全，因此，随着超声波功率的升高提取率上升；当超声波功率过高时，提取物的渗出会受到阻碍，甚至会由于空化效应太过强烈而破坏黄酮类化合物的结构使得提取率下降［21-22］；在超声波功率达到一定值后，超声介质内外渗透压基本相等，对提取物的提取影响力变弱，此时提取率趋于稳定.

图5 超声波功率对柿子叶黄酮类化合物提取率的影响

2.2.3 水浴时间对柿子叶黄酮类化合物提取率的影响

水浴时间与柿子叶中黄酮类化合物提取率的变化关系如图6 所示，随着提取的水浴时间的增加，柿子叶的中的黄酮类化合物的提取率先上升后下降. 该变化的原因与银杏叶提取效率随时间上升而下降的原因相同，提取率上升是由于提取时间的增加使得提取物内的有效成分向溶液中扩散的机率增大，提取率下降则是由于长时间的提取使得黄酮结构遭到破坏，或是银杏叶内部的杂质溶出. 结果显示，在水浴时间为1.5 h 时柿子叶中的黄酮类化合物提取率最高.

图6 水浴时间对柿子叶黄酮类化合物提取率的影响

2.3 正交试验

2.3.1 银杏叶的正交试验

银杏叶黄酮类化合物提取正交试验结果见表3，通过各因素的k值和极差分析进行直观分析，结果显示各因素对银杏叶黄酮类化合物提取效果的影响大小主次因素排序为：Α（料液比）＞B（超声波功率）＞C（水浴时间），由此可得出，料液比是影响银杏叶提取效果的重要因素. 由k值大小确定出银杏叶提取最佳条件组合是Α1B1C1，为验证正交试验结果，按Α1B1C1重新设定试验，试验设置3 个重复，经过验证试验结果可知此条件提取率达到4.18%，与正交试验结果较为一致. 因而银杏叶中的黄酮类化合物提取的最优组合为料液比为1∶20，超声波功率为144 W，水浴时间为1.0 h.

表3 银杏叶的正交试验结果

2.3.2 柿子叶的正交试验

柿子叶黄酮类化合物提取正交实验结果见表4，通过各因素的k值和极差分析进行直观分析. 结果显示对柿子叶黄酮类化合物提取效果的影响中主次因素排序为Α＞C＞B，由此可得出，料液比是影响柿子叶黄酮类化合物提取效果的重要因素，其次是水浴时间、超声波功率；由k值大小确定出柿子叶提取最佳条件组合是Α1B2C3，为验证正交试验结果，按Α1B2C3重新设定试验，试验设置3 个重复，经过验证试验结果可知此条件提取率达到2.54%（结果见表5），提取率高于正交试验表中提取率最高组，结果较为准确. 因而柿子叶中的黄酮类化合物提取的最优组合为料液比为1∶35，超声波功率为126 W，水浴时间为2.0 h.

表5 银杏叶和柿子叶的验证试验

2.4 验证试验

对正交试验的结果进行验证，分别称取银杏叶和柿子叶各3 份，放于各自的锥形瓶中，银杏叶按照优化方案Α1B1C1提取，柿子叶则按照优化方案Α1B2C3提取. 提取完成后进行黄酮类化合物的测定，计算黄酮类化合物的提取率. 结果如表5 所示，优化方案下的银杏叶的黄酮类化合物提取率平均值为4.18%，柿子叶的黄酮类化合物提取率为2.54%. 该结果和正交试验结果相符，说明此提取工艺重现性好且稳定.

3 结论

我国银杏和柿子资源丰富，但是银杏叶和柿子叶的利用率较低，为此本研究选用超声波辅助提取法来提取银杏叶和柿子叶的黄酮类化合物，以增加银杏叶和柿子叶的利用率及附加值. 本研究以黄酮类化合物提取率为指标，通过单因素试验和正交试验，得出最优提取条件为：银杏叶料液比1∶20，超声波功率144 W，水浴时间1.0 h；柿子叶料液比为1∶35，超声功率126 W，水浴时间2.0 h. 在最优组合条件下，银杏叶的黄酮类化合物提取率为4.18%，柿子叶的黄酮类化合物提取率为2.54%. 本研究大大地提高了银杏叶和柿子叶的黄酮类化合物的提取率，为银杏叶和柿子叶的提取物应用于食品、化妆品行业提供参考.