石榴皮多酚通过调控miR-4316表达抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭实验研究

施胜钰，王旭文，赵良伟，杜燕青，江明，刘重斌

1. 浙江中医药大学附属湖州中医院普外科，浙江 湖州 313000

2. 浙江中医药大学附属湖州中医院泌尿外科，浙江 湖州 313000

3. 浙江中医药大学附属湖州中医院麻醉科，浙江 湖州 313000

4. 湖州师范学院，浙江 湖州 313000

2020 年全球肺癌新发病例超220 例，死亡病例达179 万例，肺癌是全球癌症致死的首位原因[1]。尽管肺癌的诊断方法、手术技术和化疗方案不断进展，但由于肿瘤转移复发率高，其5 年生存率仍然较低[2]。微小RNA（miRNA）是在转录后调控中发挥作用的小型非编码RNA，研究报道miRNA 异常表达与细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡以及肿瘤转移等生物学过程相关，是肿瘤治疗的潜在靶点[3]。胃癌中miR-4316 表达降低，上调miR-4316 通过降低血管内皮生长因子A（VEGF-A）表达可抑制胃癌迁移和集落形成能力[4]。膀胱癌中miR-4316 具有抑癌作用，长链非编码RNA（lncRNA）钙调素类蛋白样3 基因反义RNA1（CALML3-AS1）通过抑制miR-4316 表达促进膀胱癌发生[5]。然而，miR-4316 在肺癌中的作用仍有待阐明。石榴皮多酚广泛存在于石榴的皮、果肉和籽中，具有抗氧化、抗肿瘤、调节血脂、抗炎等有益作用[6-7]。研究报道石榴皮多酚具有抵抗前列腺癌及乳腺癌的作用，可能与石榴皮多酚对细胞生长具有一定抑制作用有关，且可以促进细胞凋亡[8-9]。但石榴皮多酚在肺癌中的抗癌作用未见报道。本研究首先分析了miR-4316 在肺癌中的表达作用，并探索石榴皮多酚是否通过调控miR-4316 表达在肺癌中发挥抗肺癌功能。

1 材料与方法

1.1 组织来源将浙江中医药大学附属湖州中医院2018 年1 月—2019 年12 月行手术切除的45 例肺癌患者及癌旁组织纳入研究（男25 例，女20 例；年龄48～75 岁，中位年龄57 岁），排除术前进行放射治疗及化学治疗的患者。所有组织保存在液氮中直到使用。样本采集和使用均获得书面知情同意。本研究经浙江中医药大学附属湖州中医院伦理委员会批准（伦理编号：2021-041-A）。

1.2 细胞及试剂肺癌A549 细胞系购自中国科学院上海细胞库；细胞计数试剂盒（CCK-8）、RPMI-1640 培养基、RIPA 缓冲液购自北京索莱宝生物公司；miRNA 逆转录试剂盒、miRNA 荧光定量专用预混剂购自南京诺唯赞生物公司；miRNA 模拟物（mimics）、miRNA 抑制物（anti-miRNA）及各自阴性对照（miR-NC、anti-miR-NC）、Trizol 试剂购自上海生工生物公司；Transwell 小室购自美国BD 公司；脂质体2000 购自美国Invitrogen 公司；一抗和酶标二抗购自美国Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 RT-qPCR 检测miR-4316 表达用Trizol 试剂从肺癌组织中提取总RNA，以总RNA 为模板通过miRNA 逆转录试剂盒进行cDNA 反转录。采用miRNA 荧光定量专用预混剂进行RT-qPCR。U6 作为miR-4316 的内参，用相对定量方法（2-ΔΔCt）计算miR-4316 表达量。miR-4316 上游引物5′-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3′，下游引物5′-GGT GAG GCT AGC TGG TG-3′；U6 上游引物5′-AAC GAG ACG ACG ACA GAC-3′，下游引物5′-GCA AAT TCG TGA AGC GTT CCA TA-3′。

1.3.2 细胞培养及分组A549 细胞在含10%胎牛血清RPMI-1640 培养基置于含5%CO2、95%湿度、37 ℃温箱孵育，细胞80%汇合时1∶3 传代。取对数期A549 细胞按照2×104个/孔接种24 孔板，在细胞50%汇合时用脂质体2000 将miR-NC、miR-4316 mimics 分别转染A549 细胞以上调miR-4316 表达，分为miR-NC 组、miR-4316 组。同时，将antimiR-NC、anti-miR-4316 分别转染A549 细胞，收集转染48 h 细胞备用。参照王春梅等[9]实验方法制备石榴皮多酚，用含0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL 石榴皮多酚的培养液分别孵育A549 细胞72 h，依次记为对照组、石榴皮多酚-低组、石榴皮多酚-中组、石榴皮多酚-高组。用含2 mg/mL 石榴皮多酚的培养液分别孵育转染anti-miR-NC、antimiR-4316 的A549 细胞72 h，依次记为石榴皮多酚+anti-miR-NC 组、石榴皮多酚+anti-miR-4316 组。

1.3.3 CCK-8 检测未转染A549 细胞以及转染miR-NC、miR-4316 mimics、anti-miR-NC 或antimiR-4316 的A549 细胞接种96 孔板，贴壁后，按照1.3.2 分组，首先进行72 h 的石榴皮多酚的培养液孵育，然后进行2 h CCK-8（浓度10%）培养液孵育，吸光度（A）用分光光度计在450 nm 下测定。抑制率（%）=（1-实验A/对照A）×100%。

1.3.4 平板克隆实验每组取5×102个细胞接种6 孔板，37 ℃培养2 周后，用甲醇固定细胞集落，结晶紫染色20 min，计数大于50 个细胞的集落数。

1.3.5 划痕愈合实验将各组细胞接种于6 孔板，细胞单层采用移液枪头划伤（10 μL），然后细胞采用磷酸缓冲盐溶液（PBS）进行2 次清洗，清洗完毕在培养基（无血清）中孵育48 h。在测量开始及24 h 后以显微镜对划痕宽度进行拍照测量，划痕愈合率（%）=（初始划痕宽度-24 h 划痕宽度）/初始划痕宽度×100%。

1.3.6 Transwell 实验侵袭实验：准备好无血清培养基重悬的细胞悬液（2×105个细胞）后进行细胞接种，并将剂量为200 μL 的血清培养液置入其下室，共同置入培育箱，持续24 h 后完成培养液丢弃操作后将浓度为4%多聚甲醛置入并完成固定，染色剂采用结晶紫染色液，染色剂使用剂量为400 μL，浓度为0.5%，显微镜仪器对被侵袭的细胞进行观察并记录数量。

1.3.7 Western Blot 检测MMP-2、MMP-9 蛋白表达向各组细胞中加入RIPA 缓冲液，在冰上反应30 min，蛋白离心和定量后，将上清液按照30 μg/泳道在SDS-PAGE 凝胶上分离进行蛋白检测。将蛋白湿转到PVDF 膜，用5%脱脂牛奶在37 ℃下阻断1 h，并暴露于MMP-2 兔多克隆抗体（ab37150）、MMP-9兔多克隆抗体（ab73734）、GAPDH 兔多克隆抗体（ab9485）中4 ℃孵育过夜。用山羊抗兔IgG 酶标二抗（ab205718）在37 ℃下孵育1 h。洗膜3 次后进行化学发光显色，相对灰度值的检测采用Image J 软件。

1.4 统计学方法以SPSS25.0 对本研究中所有统计资料进行分析，确定符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，t检验2 组间数据，单因素方差检验多组间数据，LSD-t检验组间数据比较。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-4316 在肺癌组织中的表达见表1。肺癌组织中miR-4316 表达较癌旁组织低（P＜0.05）。

表1 miR-4316 在肺癌组织中的表达（）

表1 miR-4316 在肺癌组织中的表达（）

注：①与癌旁组织比较，P＜0.05

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2.2 miR-4316 过表达对肺癌A549 细胞增殖、迁移及侵袭的影响见图1～2、表2。与miR-NC 组比较，miR-4316 组A549 细胞抑制率、miR-4316 表达水平更高，克隆形成数、划痕愈合率、侵袭数、MMP-2蛋白水平及MMP-9蛋白水平表达更低（P＜0.05）。

图1 miR-4316 过表达对肺癌A549 细胞克隆形成数、划痕愈合率及侵袭数的影响（×100）

图2 miR-4316 过表达对肺癌A549 细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表2 miR-4316 过表达对肺癌A549 细胞增殖、迁移和侵袭的影响（）

表2 miR-4316 过表达对肺癌A549 细胞增殖、迁移和侵袭的影响（）

注：①与miR-NC 组比较，P＜0.05

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2.3 石榴皮多酚对肺癌A549 细胞增殖的影响见表3。石榴皮多酚-低、中、高组A549 细胞抑制率均较对照组高，克隆形成数较对照组低（P＜0.05），且具有剂量依赖性。

表3 石榴皮多酚对肺癌A549 细胞增殖的影响（）

表3 石榴皮多酚对肺癌A549 细胞增殖的影响（）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与石榴皮多酚-低组比较，P＜0.05；③与石榴皮多酚-中组比较，P＜0.05

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2.4 石榴皮多酚对肺癌A549 细胞迁移侵袭的影响见图3、表4。石榴皮多酚-低、中、高组较对照组A549 细胞划痕愈合率、侵袭数、MMP-2 蛋白水平、MMP-9 蛋白表达水平低（P＜0.05）。

图3 石榴皮多酚对肺癌A549 细胞迁移侵袭相关蛋白表达的影响

表4 石榴皮多酚对肺癌A549 细胞迁移侵袭的影响（）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与石榴皮多酚-低组比较，P＜0.05；③与石榴皮多酚-中组比较，P＜0.05

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2.5 石榴皮多酚对肺癌A549 细胞miR-4316 表达的影响见表5。石榴皮多酚-低、中、高组A549细胞miR-4316 较对照组高（P＜0.05）。

表5 石榴皮多酚对肺癌A549细胞miR-4316表达的影响（）

注：①与对照组比较，P＜0.05；②与石榴皮多酚-低组比较，P＜0.05；③与石榴皮多酚-中组比较，P＜0.05

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2.6 下调miR-4316 表达逆转了石榴皮多酚（2mg/mL）对肺癌A549 细胞增殖、迁移及侵袭的作用见图4、表6。石榴皮多酚+anti-miR-4316 组A549 细胞抑制率、miR-4316 表达水平较石榴皮多酚+anti-miR-NC组低（P＜0.05），克隆形成数、划痕愈合率、侵袭数、MMP-2 蛋白水平、MMP-9 蛋白表达水平较石榴皮多酚+anti-miR-NC 组高（P＜0.05）。

图4 下调miR-4316表达逆转了石榴皮多酚对肺癌A549细胞迁移及侵袭相关蛋白表达的作用

表6 下调miR-4316表达逆转了石榴皮多酚对肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的作用（）

表6 下调miR-4316表达逆转了石榴皮多酚对肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的作用（）

注：①与石榴皮多酚+anti-miR-NC 组比较，P＜0.05

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3 讨论

研究表明miR-4316 在乳腺癌组织表达降低，沉默环状RNA 肌凝蛋白9B（circMYO9B）通过增加miR-4316 表达能够延缓肿瘤生长，抑制乳腺癌细胞增殖和转移[10]。甲状腺癌组织中miR-4316 水平表达低，有利于甲状腺癌细胞的增殖、周期进展及侵袭[11]。在肝癌中miR-4316 低表达还参与细胞的增殖、上皮间质转化和迁移[12]。此外，结直肠癌患者外周血中miR-4316 表达升高可能是其早期诊断标志物[13]。本研究检测到肺癌组织中miR-4316 表达下调，这暗示miR-4316 低表达可能参与肺癌进展。功能测定显示，过表达miR-4316 可降低肺癌细胞克隆形成能力，抑制细胞增殖、迁移及侵袭。MMP-2 和MMP-9 是Ⅳ型胶原降解酶，其能破坏基底膜和细胞外基质促进肿瘤细胞侵袭，MMP-2 和MMP-9 表达上调与肺癌等多种人类癌症的高转移潜能有关[14-15]。本研究中过表达miR-4316 显著抑制MMP-2 和MMP-9 表达，这与其抗转移作用吻合，表明miR-4316 在肺癌中发挥抑癌功能。

石榴皮多酚具有抗增殖、抗血管生成、抗炎、抗转移等抑癌活性，研究报道从石榴中提取的多种多酚可诱导乳腺癌细胞毒性，抑制细胞侵袭和迁移能力[16]。石榴皮多酚通过调节雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/S6K 信号通路来抑制前列腺癌细胞迁移和集落形成[17]。石榴皮多酚还通过阻断肝癌细胞周期进展和诱导线粒体凋亡，抑制细胞生长[18]。此外，有报道称低剂量的石榴皮多酚对卵巢癌细胞亦具有较强抗增殖作用[19]。本研究发现石榴皮多酚以剂量依赖方式降低肺癌细胞克隆形成能力，抑制细胞增殖、迁移和侵袭，同时下调MMP-2 和MMP-9 表达水平，这提示石榴皮多酚具有抗肺癌功能。近年研究表明，miRNA 与中药有效成分的抗肿瘤作用密切相关[20-21]。例如，氧化苦参通过促进miR-367-3p 表达来抑制肺癌进展[22]。黄芩苷通过影响miR-126 的表达抑制乳腺癌细胞的侵袭及转移[23]。本研究发现石榴皮多酚处理后肺癌细胞miR-4316 表达显著增加，提示miR-4316 可能是石榴皮多酚防治肺癌的新靶标。进一步分析发现，下调miR-4316 表达显著减弱石榴皮多酚处理对肺癌细胞克隆形成、MMP-2 及MMP-9表达，还可以抑制细胞的迁移、增殖及侵袭，说明抑制肺癌的发展可以通过石榴皮多酚上调miR-4316表达来完成。但是否有其他miRNA 介导石榴皮多酚的抗癌作用仍需要不断探索。

综上所述，石榴皮多酚通过上调miR-4316 表达来抑制肺癌细胞恶性生物学行为，这些发现确定了石榴皮多酚和miR-4316 之间的新关系，为石榴皮多酚在肺癌治疗中的应用提供重要依据，也可能为抗肺癌药物开发提供新思路。