盐胁迫对裸果木幼苗生长和叶片抗逆生理指标的影响

周晓瑾,黄海霞,张 婷,齐建伟,罗永忠

(甘肃农业大学 林学院,兰州 730070)

盐渍化是引起土地荒漠化和土地退化的主要原因,由于全球气候变暖和环境恶化,以及不合理灌溉、耕作活动,盐渍土地面积呈逐年扩大的趋势,土壤盐渍化已成为全球性的生态和资源问题[1]。据联合国粮农组织(FAO)统计,目前全球盐渍化土地面积约有10亿 hm2,中国现有各类盐渍土面积约9 913万 hm2,占全国可耕地面积的25%,特别是西北地区盐渍土所占比例较大,其中甘肃盐渍化土壤面积约有141.3万 hm2,约占盐渍化耕地面积的22.81%[2]。因此,改良并利用盐渍土及修复农业生态环境在目前农业生产中显得尤为重要。推广和选育耐盐植物是改良和利用盐渍土壤有效措施之一[3]。研究发现,当土壤发生盐渍化后,首先会引起植物遭受渗透胁迫,然后造成离子失衡,继而导致离子毒害,损害植株的叶绿体色素系统,抑制Rubisco酶活性,使叶绿素含量降低,进而抑制植物的光合作用[4-5]。盐胁迫还会造成活性氧(ROS)大量积累,导致膜脂过氧化,改变细胞膜透性,引起生理代谢紊乱及有毒物质积累,从而影响植物的正常生长及形态建成[6]。研究表明,盐胁迫下可溶性小分子物质与植株的渗透调节密切相关,渗透调节是植物适应盐胁迫的主要生理机制[7,8]。植物还可通过调节抗氧化系统清除ROS积累的方式减轻或抵御盐胁迫对细胞的伤害[9]。

裸果木(Gymnocarposprzewalskii)为石竹科裸果木属亚灌木状植物,主要分布在干旱灰棕色荒漠土或棕色荒漠土的砾石戈壁或低矮的剥蚀残丘下部[10],为古地中海区旱生植物区系成分,是盐生环境中最古老的类群,对研究中国西北、内蒙古荒漠的发生、发展、气候的变化以及旱生植物区系成分的起源有重要的科学价值[11]。由于生存条件恶劣,繁殖困难,又常遭樵采和骆驼啃食,导致其分布区已日益缩小。因此,其日益受到越来越多的学者关注。目前,国内外学者对裸果木种子萌发[12]、种群结构[13-14]、形态解剖学[15]、气候变化与系统地理结构[16]及抗旱生理特性[17-18]等方面的研究较多,而盐胁迫对裸果木生理特性影响方面的系统研究报道较少。研究表明,100 mmol/L以下的NaCl处理对裸果木种子萌发率的影响不显著,萌发率可达到85%以上[12];在低浓度盐胁迫(NaCl≤0.4%)下,裸果木幼苗叶片净光合速率下降不明显,瞬时水分利用效率有所提高[19]。这些研究结果说明裸果木幼苗具有一定的耐盐性,也存在耐盐阈值,但在NaCl胁迫下,裸果木幼苗的渗透调节和抗氧化响应能力如何,迄今尚不清楚。因此,本研究以一年生裸果木为研究对象,设置不同NaCl浓度梯度模拟不同程度盐胁迫,通过控制性实验分析裸果木幼苗的生长指标及叶片渗透调节物质、抗氧化指标及光合色素含量的变化规律及差异性,探究裸果木对盐胁迫的生理响应机制及其耐盐性,以期为进一步研究裸果木耐盐性及人工种植地选择提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2021年4-8月在甘肃农业大学实验室和甘肃农业大学试验基地大棚内进行,裸果木种子采集于甘肃安西极旱荒漠国家级自然保护区植物园(E95°44′12″,N40°29′53″)。

1.2 材料培养与处理

于2021年4月采用花盆进行播种育苗,播种前先对种子和基质进行处理,种子先用10%的次氯酸钠溶液浸泡3 min,再用蒸馏水冲洗干净,最后用滤纸吸干水分。育苗基质由泥炭土和蛭石按照3∶1比例配制而成,经自然风干后装入花盆(直径17.8 cm,高度15 cm),每盆装入等量的基质(360.0 g),并按照设置的基质盐分处理和盆土干重,计算每个处理需要加入NaCl的量,分别配制成1 L的溶液,缓慢加入到基质中;每盆播种3穴,每穴4粒,深度为1 cm,待成活稳定后,每盆保留3株,于2021年5月中旬移至甘肃农业大学试验基地的塑料大棚内进行日常管护。试验共设5个处理:以蒸馏水灌溉为对照(CK),并设质量分数分别为0.4%、0.8%、1.2%和1.6% NaCl处理,每个处理3次重复(每重复4盆),每3～5 d浇等量水,若底部托盘中有渗出液则浇回盆中,以避免土壤盐分的流失。8月中旬结束控制实验,在各处理每个重复中随机取6株,测定完株高、基径后采集完整植株用于测定各器官干重,并采集其余植株的完全展开叶片,立即进行液氮速冻,放入-80 ℃超低温冰箱,用于测定生理指标。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 生长指标测量植株基部到生长点的长度为株高;测量地面根颈处的植株直径为基径。然后将每个处理植株各部分器官分开,用烘箱先调节至105 ℃杀青30 min,然后75 ℃下烘干至恒重,自然冷却后,用天平(精度0.001 g)称其根、茎、叶干重,并计算根冠比。[根生物量/(茎生物量+叶生物量)]。

1.3.2 叶片叶绿素含量

取各处理的裸果木鲜叶0.3 g,采用乙醇提取法[14]测定叶片叶绿素含量,每处理测定3个重复。

1.3.3 叶片渗透调节物质含量

叶片渗透调节物质含量参照高俊凤[20]方法测定。取不同处理的裸果木鲜叶0.3 g分别放入3支具塞试管中,加入10 mL蒸馏水,在100 ℃水浴下煮沸提取2次各30 min,定容至25 mL刻度容量瓶中,采用蒽酮法测定可溶性糖含量。取不同处理的裸果木鲜叶0.3 g,加入少许石英砂和蒸馏水在预冷的研钵中研磨成匀浆后倒入10 mL容量瓶中,在10 000 r/min离心10 min,上清液即为可溶性蛋白提取液,其含量采用考马斯亮蓝G-250染色法测定。取不同处理的裸果木鲜叶0.5 g,剪碎混匀置于具塞试管中,加入10 mL 3%的磺基水杨酸溶液,在沸水浴中提取10 min(提取过程中要经常摇动),上清液即为脯氨酸的提取液,其含量采用磺基水杨酸提取法测定。

1.3.4 叶片相对电导率

采用电导仪法测定[21]。取各处理的裸果木鲜叶0.3 g,加10 mL纯水,用真空泵抽气15 min左右,抽出间隙中的空气后,再重新缓缓放入空气,在室温保持30 min,用DDS-11A型电导仪测定各处理电导率,然后在沸水浴中保持5 min,自然冷却后再用电导仪测定煮沸后电导率,各处理重复3次。

1.3.5 叶片丙二醛含量

取不同处理裸果木鲜叶0.3 g样品于研钵,加5%三氯乙酸2 mL,研磨后,将匀浆倒入离心管,用三氯乙酸定容至5 mL,在3 000 r/min下离心10 min,取上清液即为丙二醛提取液,采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量[20]。

1.3.6 叶片抗氧化酶活性

叶片抗氧化酶活性参照高俊凤[20]方法测定。取不同处理裸果木鲜叶0.2 g,置于预冷的研钵中,加入50 mmol/L pH为7.8的磷酸缓冲液,研磨成匀浆定容,在4 ℃条件下10 000 r/min离心20 min,上清液即为酶粗测定液。分别采用氮蓝四唑光还原法、愈创木酚法、紫外吸收法测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010整理数据;采用 SPSS 26.1软件进行方差分析(ANOVA),采用Duncan法检验处理间差异的显著性;采用Origin 2018作图。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对裸果木幼苗生长的影响

表1显示,随着盐胁迫浓度的增加,裸果木幼苗株高、基径和干重均逐渐降低,而其根冠比逐渐增加。其中,裸果木幼苗株高、基径和根干重在0.4% NaCl处理下比对照略有降低,而在0.8% NaCl处理下则比对照分别显著降低45.8%、53.3%和33.3%,表明裸果木幼苗生长受到了高盐胁迫(0.8%、1.2%和1.6%)的显著抑制;同时,裸果木幼苗茎干重、叶干重和总干重均表现出相同的变化趋势,即在各浓度NaCl胁迫处理下均显著低于对照,且1.6% NaCl处理下比对照分别显著降低80.9%、90.9%和76.3%;另外,裸果木幼苗根冠比则在各浓度NaCl处理下均比对照显著升高,在1.6%盐胁迫下达到对照的2.5倍。

表1 盐胁迫下裸果木幼苗形态生长指标的变化

总体来看,盐胁迫严重抑制了裸果木幼苗的形态生长,且NaCl处理浓度越高抑制程度越大;盐胁迫显著限制了裸果木幼苗总生物量的积累,且对叶、茎生长的限制作用大于根系。

2.2 盐胁迫对裸果木幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

从图1可知,随着NaCl胁迫浓度的增加,裸果木幼苗叶片可溶性糖(SS)和可溶性蛋白(SP)含量均呈现先上升后下降趋势,并均在0.4% NaCl处理下达到最大值,且各胁迫处理均显著高于对照水平;同时相应的叶片脯氨酸(Pro)含量则表现出逐渐大幅度增加的趋势,且除0.4% NaCl处理外也均与对照差异显著。其中,裸果木幼苗叶片SS和SP含量在0.4% NaCl处理下均达到最大值,较对照分别显著增加了70.2%和136.8%;当盐浓度超过0.4%时,叶片SS和SP含量则逐渐下降,但仍均显著高于对照,增幅分别为23.0%～33.2%和32.0%～75.1%,0.8%和1.2% NaCl处理之间差异均不显著;裸果木幼苗叶片Pro含量在0.8%、1.2%和1.6% NaCl处理下较对照分别显著提高116.9%、126.0%和169.3%,而0.8%与1.2% NaCl处理间无显著差异。以上结果说明,裸果木幼苗在0.4% NaCl处理(低盐胁迫)下主要积累可溶性糖和可溶性蛋白,在0.8%和1.2% NaCl处理(中高盐胁迫)下主动显著增加脯氨酸积累来弥补可溶性糖和可溶性蛋白积累的不足,而在1.6% NaCl处理时(高盐胁迫),进一步主动大幅增加脯氨酸积累,三者相互协作来共同发挥渗透调节作用,表现出一定的补偿效应。

不同小写字母表示处理间在0.05水平存在显著性差异。下同。

2.3 盐胁迫对裸果木幼苗叶片丙二醛含量和相对电导率的影响

由图2可知,裸果木幼苗叶片丙二醛(MDA)含量和相对电导率(REC)均随着NaCl处理浓度的增加呈逐渐升高趋势。其中,裸果木幼苗叶片MDA含量在0.4% NaCl处理下仅比对照稍高,而在0.8%～1.6% NaCl处理下比对照显著升高了56.8%～122.1%,且0.8%和1.2%两个NaCl处理之间差异不显著;在0.4%～1.6% NaCl处理下,裸果木幼苗叶片REC比对照显著上升了24.1%～59.9%,而1.2%和1.6% NaCl处理之间差异不显著性。以上结果表明,当NaCl处理浓度超过0.4%时,裸果木叶片膜系统受到了明显的过氧化损伤,造成电解质大量外渗。

图2 盐胁迫下裸果木幼苗叶片丙二醛含量及相对电导率的变化

2.4 盐胁迫对裸果木幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

裸果木幼苗叶片超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性在各浓度NaCl胁迫下均比对照不同程度提高,且增幅大多达到显著水平(图3)。其中,随着NaCl处理浓度的增加,叶片SOD和POD活性均呈先升高后下降的变化趋势,它们分别在0.8%和0.4% NaCl处理下达到最大值,分别较对照显著升高了43.4%和45.9%(图3,A、B);而叶片CAT活性则随着NaCl处理浓度的增大而逐渐升高,且都与对照差异达到显著水平,增幅在57.6%～195.1%之间(图3,C)。以上结果表明,裸果木幼苗叶片POD和CAT活性在各浓度盐胁迫下均显著增强,而其SOD活性在盐浓度超过0.4%时也显著增强,均对清除ROS发挥了显著作用,有效缓解自由基对膜系统的损伤,且CAT活性增强的幅度更大。

2.5 盐胁迫对裸果木幼苗叶片叶绿素含量的影响

随着NaCl处理浓度的增加,裸果木幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量均逐渐降低,但在0.4% NaCl处理下比对照降低均不显著,在0.8%～1.6% NaCl处理下均比对照显著降低,降幅分别为45.8%～54.2%、67.1%～94.9%、74.3%～82.6%和54.0%～70.0%(表2)。由此可见,各浓度NaCl处理均抑制了裸果木幼苗叶片光合色素的合成,导致光合色素含量均不同程度降低,且NaCl处理浓度越高下降幅度越大。

表2 盐胁迫下裸果木幼苗叶片叶绿素含量的变化

3 讨 论

盐胁迫对植物的伤害作用主要包括渗透胁迫、离子毒害和营养失衡等方面,但最终体现在植物生长抑制,根冠比增加,甚至导致死亡[22]。生长量和植株形态作为评估盐胁迫程度和植物抗性的最直接指标[23],相关研究表明,在盐胁迫条件下,藜麦幼苗根部和茎部生长均受到抑制,且NaCl处理浓度越高,受抑制现象越明显[24]。本试验中低盐胁迫对裸果木生长影响较小,但当NaCl处理超过0.4%时,根、茎、叶干重以及株高、基径均显著降低,同时植株矮小、叶色变淡。这表明裸果木具有一定的耐盐性。

叶绿素是植物进行光合作用的主要化学物质,其含量多少能够直接反映植物叶片光合代谢能力的强弱[25]。盐胁迫环境下,植物叶绿体结构受损,叶绿素合成与降解失衡,从而使其光合作用受到抑制。本研究结果发现,裸果木幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素和总叶绿素含量在盐胁迫下均明显下降,且随着盐胁迫程度的加重,其含量下降幅度越大,这可能是由于较高浓度的盐胁迫破坏了土壤中的离子稳态,使得与叶绿素合成有关的离子(Mg2+、Cu2+、Fe2+)沉淀,进而减缓了叶绿体对光能的吸收能力,降低了色素与色素蛋白之间的亲合能力,使类囊体膜破坏,最终导致叶绿素含量降低[26-28]。类胡萝卜素既是光合色素又是细胞内源抗氧化剂,既可以吸收部分光能,又能吸收PSⅡ的过剩能量,在一定程度上可以保护叶绿体[29],本研究中类胡萝卜素含量下降可能是盐胁迫下产生的活性氧消耗了类胡萝卜素[5],具体的机理有待进一步研究。

盐胁迫环境条件下,植物细胞会主动积累一些渗透调节物质,维持高的细胞质渗透压,以保障植物细胞能抵御盐胁迫[30],可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸是植物体内主要渗透调节物质,这些物质的积累便于植物在盐分环境下对水分的吸收,从而保证植物的正常生理活动[31-33]。在本研究中,NaCl浓度低于0.4%时,裸果木幼苗叶片SS和SP含量显著高于对照,说明叶片通过积累大量的SS和SP来抵御NaCl胁迫对裸果木的伤害;但随着NaCl胁迫的加重, SS和SP含量有所下降,这可能是由于细胞内叶绿素含量下降,光合速率减弱,合成物减少而导致SS含量下降和SP合成受限,本研究与罗达等[34]的研究结果相似。本研究中NaCl处理浓度超过0.4%时,裸果木幼苗叶片Pro含量显著提高,且在1.6% NaCl处理下达到最大值,表明高盐环境能显著诱导Pro的渗透调节作用,曹齐卫等[35]的研究也得出了类似的结论。从盐胁迫下3种渗透调节物质的变化规律来看,Pro与SS和SP的积累进程存在补偿作用。

植物细胞膜主要起着调节和控制细胞内外物质交换和运输的作用,主要有磷脂和蛋白质组成,具有选择通透性[36]。盐胁迫导致细胞膜结构受损,膜透性增大,细胞内的电解质外渗,继而导致电导率升高。因此,相对电导率可表征植物遭受盐胁迫伤害的程度,即相对电导率越大,细胞膜透性越大[37]。此外,盐胁迫还会引起植物的脂质过氧化作用,其中MDA作为膜脂过氧化反应的主要产物之一,其含量的多少在一定程度上能够反映出膜损伤程度的大小[38-39]。本研究中,裸果木幼苗MDA含量随着NaCl胁迫的加重而逐渐上升,但其在0.4% NaCl处理下与对照相比增加较少且含量较低;而当NaCl处理高于0.8%时,MDA含量增加显著,这说明当盐浓度较低时,裸果木叶片细胞膜伤害的程度小,随着盐浓度的增加,膜结构严重受损。

4 结 论

本研究通过对裸果木在NaCl胁迫下的生长状况、渗透调节物质、膜系统的稳定性、抗氧化酶系统和叶绿素含量的分析可知,在0.4%NaCl处理下,裸果木幼苗的株高、基径、根干重、膜脂过氧化程度和光合色素含量变化不明显,可溶性糖和可溶性蛋白显著积累,POD和CAT活性显著增强,对盐胁迫表现出一定的耐受能力。当NaCl处理浓度≥0.8%时,裸果木幼苗叶片叶绿素含量显著下降,膜脂过氧化作用明显加剧,膜透性显著增大,可溶性糖和可溶性蛋白含量降低,抗氧化酶活性减弱,干物质的合成与积累受到显著抑制。