基于UPLC指纹图谱及多指标成分含量的罗汉果质量分析

张芳平，刘晓霞，位翠杰，冯涌微，何民友，夏天睿，陈向东，孙冬梅，李振雨

广东一方制药有限公司，广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

罗汉果为葫芦科植物罗汉果Siraitia grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y. Zhang的干燥果实，有清热润肺、利咽开音、滑肠通便功效[1]，是原卫生部于2002年公布的我国首批药食同源中药（卫法监发〔2002〕51号）。罗汉果是广西道地药材之一，多分布于广西壮族自治区桂林市、柳州市等地[2]。研究表明，罗汉果含有黄酮类、皂苷类、多糖类、多酚类等活性成分，有抗菌、抗炎、抗氧化等作用[3-4]，可用于治疗肿瘤、肝脏疾病，具有丰富的营养价值与药用价值[5-7]。目前，罗汉果应用广泛，2020年版《中华人民共和国药典》仅以单一成分罗汉果苷Ⅴ作为罗汉果的质量标志物（Q-Marker），无法全面评价罗汉果的内在质量，因此，亟需建立完整的罗汉果质量评价体系。同时，相关研究表明，除罗汉果皂苷Ⅴ外，葫芦烷型四环三萜类罗汉果苷Ⅱe、罗汉果苷Ⅲe、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ等，黄酮苷类山柰苷等，小分子醛类5-羟甲基糠醛等是罗汉果的重要化学成分[8]，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用。因此，本研究通过建立罗汉果药材UPLC指纹图谱并对其多指标成分进行含量测定，结合化学计量学分析，全面评价罗汉果药材的质量，为完善罗汉果药材质量标准提供依据。

1 仪器与试药

U3000超高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；ME204E万分之一天平、XP26百万分之一天平，梅特勒-托利多公司；HWS28电热恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司。

15批罗汉果药材，经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定，均为葫芦科植物罗汉果Siraitia grosvenorii（Swingle）C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z. Y.Zhang的干燥果实，批号LHG01～LHG05样品（编号L1～L5）产地为广西壮族自治区柳州市（广西柳州），批号LHG06～LHG15样品（编号L6～L15）产地为广西壮族自治区桂林市（广西桂林）。对照品罗汉果皂苷Ⅴ（批号111754-201703，含量94.0%，中国食品药品检定研究院），山柰苷（批号20110503，含量99.63%，成都普菲德生物有限公司），11-O-罗汉果皂苷Ⅴ（批号DST200903-032，含量99.39%，成都乐美天生物技术有限公司），5-羟甲基糠醛（批号111626-202215，含量99.5%，中国食品药品检定研究院）。甲醇（分析纯，西陇科学股份有限公司），乙腈（色谱纯，默克股份有限公司），磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱建立

2.1.1 色谱条件

采用Waters Cortecs T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～6 min，2%～7%A；6～17 min，7%～15%A；17～19 min，15%～19%A；19～28 min，19%～22%A；28～35 min，22%～27%A；35～40 min，27%～90%A），流速0.30 mL/min，检测波长0～25 min为300 nm、25.1～40 min为203 nm，柱温43 ℃，进样量1 μL。

2.1.2 对照品溶液制备

取5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ、罗汉果皂苷Ⅴ对照品适量，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含5-羟甲基糠醛51.614 μg、山柰苷22.914 μg、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ 31.656 μg、罗汉果皂苷Ⅴ 52.230 μg的溶液，即得混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备

取罗汉果药材粉末（过四号筛）约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 方法学考察

2.1.4.1 精密度试验

取罗汉果药材（编号L2）供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，以峰15罗汉果皂苷Ⅴ为参照峰S，计算各共有指纹峰与S峰的相对保留时间RSD为0.32%～1.53%，相对峰面积RSD为0.65%～1.59%，均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.2 重复性试验

取罗汉果药材粉末（过四号筛，编号L2）约1.0 g，平行6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以峰15罗汉果皂苷Ⅴ为参照峰S，计算共有指纹峰与S峰的相对保留时间RSD为0.52%～1.75%，相对峰面积RSD为0.75%～1.85%，均小于3.00%，表明该方法重复性良好。

2.1.4.3 稳定性试验

取“2.1.4.2”项下罗汉果药材供试品溶液，分别于制备后0、3、6、10、16、24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，以峰15罗汉果皂苷Ⅴ为参照峰S，计算各共有指纹峰与S峰的相对保留时间RSD为0.01%～0.05%，相对峰面积RSD为0.18%～1.94%，均小于3.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.4.4 共有指纹峰确定及相似度评价

按上述方法对15批罗汉果药材进行测定，并将指纹图谱CDF格式导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行处理。以L1样品指纹图谱为参照，进行多点校正和峰匹配，并生成对照指纹图谱，15批样品指纹图谱叠加图见图1，对照指纹图谱见图2。15批样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度计算结果见表1。采用对照品比对结合紫外-可见光3D光谱分析对共有峰进行指认，结果见图3。15批样品共呈现16个共有色谱峰，峰2为5-羟甲基糠醛，峰12为山柰苷，峰14为11-O-罗汉果皂苷Ⅴ，峰15为罗汉果皂苷Ⅴ。除L9样品指纹图谱相似度为0.894，其余14批样品指纹图谱的相似度均大于0.900，表明指纹图谱能够作为共性特征用于罗汉果药材的质量控制。

表1 15批罗汉果药材指纹图谱相似度评价

图2 罗汉果药材对照指纹图谱

图3 罗汉果药材指纹图谱共有色谱峰指认

2.2 化学计量学分析

2.2.1 聚类分析

为进一步分析不同产地罗汉果药材是否存在差异，采用SPSS25.0软件对15批罗汉果药材的16个共有峰进行系统聚类分析，结果见图4。当组间联接距离为17～25时，15批罗汉果药材聚为2类：编号L1～L5样品为一类，编号L6～L15样品为另一类。聚类结果显示出明显的产地相关性，广西柳州样品和广西桂林样品分别聚为一类。

图4 15批罗汉果药材聚类树状图

2.2.2 主成分分析

采用SIMCA14.1软件，以16个共有峰的峰面积为变量进行主成分分析（PCA），15批罗汉果药材PCA得分图见图5。15批样品基本分为2类，其中广西柳州样品为一类（L1～L5），广西桂林样品（L6～L8、L10～L15）为另一类，与聚类分析结果基本一致。

图5 15批罗汉果药材PCA得分图

2.2.3 正交偏最小二乘-判别分析

采用SIMCA14.1软件，以16个共有峰的峰面积为变量进行正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA），结果模型R2X=0.998，Q2=0.694，其中Q2＞0.5表明模型有效。15批罗汉果药材OPLS-DA得分图见图6。以变量重要性投影（VIP）＞1.0为条件对差异成分进行筛选，共得到6个差异标志物，按VIP值排序为：峰13＞峰9＞峰5＞峰7＞峰15（罗汉果皂苷Ⅴ）＞峰2（5-羟甲基糠醛），见图7。

图6 15批罗汉果药材OPLS-DA得分图

图7 罗汉果药材指纹图谱共有峰VIP图

2.3 含量测定

2.3.1 线性关系考察

取5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷V和罗汉果皂苷Ⅴ对照品适量，加甲醇制成每1 mL含5-羟甲基糠醛101.56 μg、山柰苷56.23 μg、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ 1 011.90 μg、罗汉果皂苷Ⅴ 2 204.50 μg的混合对照品母液。分别精密量取混合对照品母液3、2、1.5、0.5、0.3 mL，转移至5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列混合对照品溶液。分别取上述对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标、对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表2。5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ的相关系数均大于0.999 0，表明峰面积与对照品浓度在相应范围内线性关系良好。

表2 罗汉果中4种成分线性关系考察结果

2.3.2 精密度试验

取“2.1.2”项下混合对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ对照品峰面积，并计算RSD为0.15%～0.20%，均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

取罗汉果药材粉末（过四号筛，编号L2）1.0 g，按“2.1.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样。结果罗汉果药材中5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ平均含量分别为1.339、0.241、2.785、11.745 mg/g，且RSD为0.04%～1.31%，均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

取罗汉果药材粉末（过四号筛，编号L2）1.0 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、3、6、10、16、24 h，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果表明，罗汉果药材中5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ的峰面积RSD为0.15%～1.23%，均小于3.00%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验

精密称取已知含量的罗汉果药材粉末（过四号筛，编号L2）0.5 g，共9份，分为3组，每组平行3份，按对照品与样品中待测成分含量为0.5∶1、1∶1、1.5∶1比例分别加入5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ对照品，按“2.1.3”项下方法制备9份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，结果5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ平均加样回收率分别为96.36%、98.13%、99.51%、96.37%，RSD为1.84%～2.43%，均小于3.00%，表明加样回收率良好，见表3。

表3 罗汉果药材中4种成分加样回收率试验结果

2.3.6 样品测定

分别取15批罗汉果药材粉末1.0 g，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，平行2份，并按“2.1.1”项下色谱条件测定，采用外标法计算5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ含量，结果见表4。15批罗汉果药材5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ和罗汉果皂苷Ⅴ平均含量分别为0.402、0.195、3.543、15.339 mg/g。其中广西柳州和广西桂林样品山柰苷和11-O-罗汉果皂苷Ⅴ含量无明显差异，广西柳州样品5-羟甲基糠醛含量（1.009 mg/g）高于广西桂林样品（0.235 mg/g），广西柳州样品罗汉果皂苷Ⅴ含量（13.224 mg/g）低于广西桂林样品（16.397 mg/g），可知，广西柳州和广西桂林产地的罗汉果药材质量存在一定差异。2020年版《中华人民共和国药典》罗汉果项下规定罗汉果皂苷Ⅴ含量不得少于0.5%。15批罗汉果药材罗汉果皂苷Ⅴ含量均符合规定，药材质量较好。

表4 15批罗汉果药材中4种成分含量测定结果（mg/g）

3 讨论

PDA检测器全波长扫描结果显示，罗汉果药材中极性较大的酚酸类和黄酮类成分在25 min内被洗脱，且在波长300 nm处有较高的紫外吸收；25 min后，极性较小的葫芦烷型萜类成分被洗脱，该类物质在波长203 nm处有较弱的紫外吸收。因此，本研究采用波长切换方式建立罗汉果药材指纹图谱，从而获得更多的指纹峰信息，即检测波长0～25 min为300 nm、25.1～40 min为203 nm。

本研究以总峰面积/称样量值和分离度为评价指标，考察不同溶剂（甲醇、50%甲醇、70%甲醇、乙醇、50%乙醇、70%乙醇）及提取方式（超声、加热回流）对罗汉果药材提取效果的影响。结果表明，当提取溶剂为甲醇时，其总峰面积/称样量值最大且分离度好，即提取效果最佳。采用加热回流提取方式，各指纹峰的总峰面积/称样量值大于超声提取且分离度最佳。

本研究利用超高效液相色谱仪建立15批罗汉果药材指纹图谱，结果表明，15批样品指纹图谱呈现16个共有峰；除L9以外，其余14批样品指纹图谱相似度大于0.900，可能由于样品均采自广西，故相似度较高，质量较为一致。

本研究应用化学计量学方法评价罗汉果药材质量，聚类分析及PCA表明，除L9以外，广西柳州样品基本聚为一类，广西桂林样品聚为一类，表现出明显的产地相关性。L9分布显示异常，与其他批次差异较大，可能是由于药材的生长年限、产地加工或者采收后的贮藏环境不同导致。通过VIP＞1筛选出峰2（5-羟甲基糠醛）、峰5、峰7、峰9、峰13、峰15（罗汉果皂苷Ⅴ）为罗汉果药材质量控制的差异标志物，表明本研究可能为罗汉果整体质量评价系统的建立提供依据。

罗汉果所含黄酮苷类成分山柰苷具有镇痛、消炎、抗糖尿病、抗肿瘤等作用[4]；葫芦烷型萜类成分罗汉果苷Ⅲe、11-O-罗汉果苷Ⅴ等具有利咽开嗓等功效[5]；罗汉果皂苷V具有抗氧化、抗肿瘤、止咳润肺、降血糖等作用[5]，是2020年版《中华人民共和国药典》规定的含量测定指标；5-羟甲基糠醛是小分子醛类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、延缓记忆功能衰退等作用，但也有一定的细胞毒性，过量食用可能造成中毒，致内脏损害[9]。当5-羟甲基糠醛含量高于0.02%时，中药材会出现严重的变质现象[10]。罗汉果中5-羟甲基糠醛含量与色泽、贮藏年份之间未见明显相关性[11]。罗汉果经高温加工，其内部糖分发生Maillard反应生成较多的5-羟甲基糠醛，常温贮藏其含量不会发生明显变化[9]，5-羟甲基糠醛含量是影响罗汉果药材质量的重要因素之一。

由于罗汉果富含多种有效化学成分，单一指标成分难以对罗汉果药材质量进行整体评价，多指标含量测定对罗汉果质量评价具有重要作用。基于此，本研究选择5-羟甲基糠醛、山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ、罗汉果皂苷Ⅴ作为罗汉果药材的含量测定指标。结果表明，广西柳州和广西桂林罗汉果药材中山柰苷、11-O-罗汉果皂苷Ⅴ含量相差不大，表明广西罗汉果药材质量较为一致；广西柳州样品5-羟甲基糠醛含量高于广西桂林样品，这可能与产地加工方式相关，具体原因有待进一步研究；广西柳州样品罗汉果皂苷Ⅴ含量略低于广西桂林样品，表明广西桂林罗汉果药材质量可能优于广西柳州。广西不同产地罗汉果药材质量存在一定差异，表明除罗汉果皂苷Ⅴ以外，5-羟甲基糠醛很可能成为罗汉果的Q-maker，进而为罗汉果整体质量评价系统的建立提供依据。

综上，罗汉果作为广西的道地药材之一，其质量评价体系有待进一步完善，本研究可为全面评价罗汉果药材质量提供依据。同时，本研究存在一定不足，如样品批次较少、未考虑加工处理对药材质量的影响等，有待进一步深入研究。