Agtr1a 调节LPS 诱导的Lbp－／－小鼠原代肝细胞炎症

米传靓付彬*李思迪陈志达郭中坤张振宇王可洲*

（1. 山东第一医科大学（山东省医学科学院）实验动物学院（省实验动物中心），济南 250117；2. 济南朋悦实验动物繁育有限公司，济南 250000）

脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）作为分泌型Ⅰ类急性期蛋白，主要在肝细胞中产生，并在先天免疫应答中发挥关键作用［1］。 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也称为内毒素，是革兰氏阴性菌的外膜结构，同时也是免疫系统最有效的诱导剂之一［2］。 LBP 与LPS 结合并调节炎症反应［3］。 有研究证明敲除LBP 可以降低LPS 诱导的大鼠炎症因子水平，从而对机体起到保护作用［4］。 前期研究发现，Lbp－／－小鼠虽无法正常表达LBP，但仍会将LPS 信号传递给靶细胞引起迟发炎症反应［5］，表明LPS 诱导信号传递可能存在代偿途径。 因此，以Lbp－／－小鼠为背景研究LPS 信号传递的代偿途径，对解决由革兰氏阴性菌引起的炎症反应有重要意义。

血管紧张素受体1a 型（Agtr1a angiotensin Ⅱreceptor， type 1a， Agtr1a）作为G 蛋白偶联受体（GPCR），含有信号转导所必需的七跨膜螺旋结构。活化的Agtr1a 将激活细胞内信号传导并触发多种信号通道如细胞内蛋白激酶［6］如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族、细胞外信号调节激酶ERK、c-JunN-末端激酶（JNK）和p38 MAPK［7］。 Agtr1a 的促炎效应是通过激活信号通路来表达促炎介质，如细胞因子、趋化因子和粘附分子等。 ERK1／2 途径由多种细胞表面受体（如生长因子、细胞因子受体、G 蛋白偶联受体等）激活，其被磷酸化激活后转位入核，调节TNF-α、IL-1β 等炎症因子的表达［8］。 本文旨在证明Agtr1a 通过激活MAPK／ERK 通路调节LPS 诱导的Lbp－／－小鼠原代肝细胞炎症反应；氯沙坦是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，主要用于选择性阻断AT1 受体［9］，而RNAi 则是通过特定靶点来降低Agtr1a 的表达，抑制Agtr1a 活性或降低Agtr1a表达均能有效地降低由LPS 诱导的Lbp－／－小鼠肝细胞炎症反应，为LPS 所致的炎症治疗探索新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级健康雌性Lbp－／－小鼠10 只，SPF 级健康雌性C57BL／6J 小鼠4 只，周龄为6 ～8 周，体重20～22 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司【SCXK（鲁）2019 0003】，饲养于山东省实验动物中心【SYXK（鲁）2019－0007】，并经60Co 灭菌。 昼夜各半并循环照明，温度控制在22 ～25℃，湿度60% ±5%，饲养期间自由进食、进水。 实验动物使用遵循3R 原则，所有实验操作均经山东省实验动物中心伦理审批（SYDW20220403-1）。

LPS（sigma，L5418），干扰RNA（北京擎科生物科技公司合成），Losartan（Selleck，S1359），RNA 提取试剂盒 （ Omega， R6934-02 ）， Anti-β-actin（Cohension， CPA9100）， Anti-ERK1／2 （Cohension，CPA1944），Anti-p-ERK（Cohension，CPA4924），Anti-AT1（Cohension，CQA8011），Goat Anti-Rabbit IgG（Cohension， CSA1036）， LipofectamineTMRNAiMAX转染试剂（Invitrogen，13778-150）。 显微镜（ZEISS，德国）， 细胞培养箱（Thermo， 德国）， 酶标仪（SpectraMax，美国），蛋白电泳和印迹系统（Bio-Rad，美国），凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）Nanodrop（Thermo，德国），荧光定量PCR 仪（Thermo，德国）。

1.2 方法

1.2.1 原代肝细胞的分离与提取

利用改良版两步灌流法提取WT 型、Lbp－／－型小鼠原代肝细胞，将小鼠麻醉后，75%乙醇皮肤消毒，打开腹腔。 用37℃、pH ＝ 7.4 的灌洗液Ⅰ（含有0.375 g／L EGTA 的D-Hanks 溶液）按20 mL／min 流速进行肝灌注约30 mL，灌入的同时剪开肝门静脉，随后用灌流液Ⅱ（含0.5 g／L 胶原酶Ⅳ的高糖培养基）灌流约30 mL 至肝软塌出现皲裂。 剪下肝放置培养皿中，加入15 mL 完全培养基，撕裂肝包膜，形成肝细胞混悬液，用70 μm 细胞网滤过，收集滤液。600 r／min，离心3 min，弃上清，重复3 次。 加入新鲜细胞培养基混匀，台盼蓝计数活细胞数（活细胞数＞80%则用于后续实验）。 接种细胞，待细胞贴壁后更换培养液，并进行后续实验。

1.2.2 细胞分组与LPS 刺激炎症模型的构建

将WT 型小鼠原代肝细胞分为对照组（空白对照）、LPS 组（LPS 刺激）；Lbp－／－型小鼠原代肝细胞抑制剂法将细胞分为对照组A（空白对照）、LPS 组A（LPS 刺激）、抑制剂组（氯沙坦干预3 h 后加入LPS 刺激）；Lbp－／－型小鼠原代肝细胞siRNA 转染法将细胞分为对照组B（空白对照）、LPS 组B（LPS 刺激）、阴性对照组（si-NC 干扰12 h 后加入LPS 刺激）、干扰组（si-agtr1a 干扰12 h 后加入LPS 刺激）。提取原代肝细胞后，按照70%细胞满度铺于六孔板，细胞贴壁过夜后，各对照组不做处理，其他组均加入LPS 使其终浓度10 μg／mL，刺激时间12 h，进行后续实验。

1.2.3 抑制剂处理原代肝细胞

提取Lbp－／－型小鼠原代肝细胞，按照70%细胞满度铺于六孔板，细胞培养贴壁过夜后，于次日处理细胞，对照组A 不做处理，抑制剂组中加入氯沙坦使其终浓度为0.1 μmol／L，3 h 后于LPS 组A、抑制剂组中加入终浓度10 μg／mL LPS 刺激12 h，收集样品待用。

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1.2.4 siRNA 转染细胞

提取Lbp－／－型小鼠原代肝细胞，按照70%细胞满度铺于六孔板，细胞贴壁后将培养基更换成无双抗培养基，过夜培养，于次日进行细胞转染，对照组B 不做处理，阴性对照组中加入终浓度为50 nmol／L的si-NC，干扰组中加入终浓度为50 nmol／L 的si-agtr1a， 6 ～8 h 后更换培养基，转染12 h 后LPS组B、阴性对照组、干扰组中分别加入终浓度10 μg／mL LPS 处理12 h，收集样品待用。 si-agtr1a 的靶向序列为：GCTTGGTGGTGATCGTCAT；正义链为：5’-GCUUGGUGGUGAUCGUCAU（dT）（dT） -3’；反义链为：5’-AUGACGAUCACCACCAAGC（dT）（dT） -3’。

1.2.5 荧光定量qPCR 检测相关基因表达

用RNA 提取试剂盒提取各组细胞中RNA，逆转录法合成cDNA，用荧光定量PCR 试剂盒进行RT-qPCR 反应，以2－ΔΔCT法计算基因表达。 Agtr1a 上游引物序列：5’-CTAAGGCCATTCTACTTGGGGT-3’，下游引物序列：5’-CGAGTGCAGATGCCGATGA-3’；β-actin 上游引物序列：5’-GGCTGTATTCCCCT CCATCG-3’，下游引物序列：5’-CCAGTTGGTAAC AATGCCATGT-3’；IL-1β 上游引物序列：5’-GCAA CTGTTCCTGAACTCAACT-3’，下游引物序列：5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’；TNF-α 上游引物序列：5’-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3’，下游引物序列：5’-GCTACGACGTGGGCTACAG-3’。

1.2.6 CCK-8 检测细胞存活率

将细胞以1 × 104个／孔接种于96 孔板，每组设3 个复孔。 10 μg／mL LPS 刺激12 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，继续培养，3 h 后于酶标仪上测定450 nm 波长处的吸光值。

1.2.7 Western Blot 法检测LBP、Agtr1a、ERK、p-ERK 蛋白

取3 组小鼠原代肝细胞，加入RIPA 裂解液100 μL 冰上充分裂解，4℃，12 000 r／min 离心10 min 取上清，应用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；待测样本加入蛋白上样缓冲液，100℃煮沸变性。 取25 μg 蛋白，进行SDS-PAGE 电泳（浓缩胶恒压80 V电30 ～40 min，Marker 进入分离胶后110 V 电泳至结束），半干转法将蛋白转至PVDF 膜（恒压25 V，电流130 mA，转膜9 min）。 5%脱脂奶粉37℃封闭2 h；加入LBP、Agtr1a、ERK、p-ERK 和β-actin 一抗（1 ∶500 ～1 ∶1000），4℃孵育过夜，1 × TBST 洗涤3 次每次15 min；加入二抗（1 ∶3000 ～1 ∶5000），室温孵育2 h，1 × TBST 洗涤3 次每次15 min；加入ECL 化学发光液，凝胶成像仪显影，以β-actin 为内参，计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

实验数据采用Graphpad 8.4.2 软件进行统计学分析，结果用平均值± 标准差（±s）表示。 两组间比较采用非配对t检验法进行差异分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义；多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Lbp－／－小鼠原代肝细胞LBP 蛋白表达量的鉴定

Western Blot 结果表明，Lbp－／－小鼠原代肝细胞中LBP 蛋白已敲除完全并不再表达，见图1。

图1 LBP 蛋白表达结果Figure 1 LBP protein expression result

2.2 LPS 刺激下Agtr1a 表达的变化

Western Blot 结果表明，野生型小鼠原代肝细胞在LPS 刺激下Agtr1a 蛋白表达量没有显著变化（P＞0.05），如图2A；Lbp－／－小鼠原代肝细胞LPS 刺激后Agtr1a／β-actin 的比值显著升高（P＜0.05），加入抑制剂后其Agtr1a 蛋白表达量显著降低（P＜0.001），如图2B；加入干扰RNA 后，Agtr1a 蛋白表达量显著降低（P＜0.0001），如图2C。

图2 LPS 刺激条件下Agtr1a 表达的变化Figure 2 Changes in Agtr1a expression under LPS stimulation

2.3 抑制Agtr1a 对Lbp－／－小鼠原代肝细胞存活率的影响

CCK8 结果显示，与LPS 组相比，抑制剂组细胞存活率显著上升（P＜0.01），如图3A；干扰组细胞存活率虽有上升，但无显著性变化，如图3B。

图3 抑制Agtr1a 对Lbp－／－小鼠原代肝细胞存活率的影响Figure 3 Effect of inhibiting Agtr1a on survival rate of primary hepatocytes in Lbp－／－mice

2.4 抑制Agtr1a 蛋白表达对炎症因子的影响

荧光定量PCR 结果显示，加LPS 刺激后，Lbp－／－小鼠原代肝细胞炎症因子升高；加入抑制剂氯沙坦后，炎症因子TNF-α、IL-1β 表达量均显著降低（P＜0.0001；P＜0.01），即抑制剂抑制Agtr1a 蛋白表达后，能抑制炎症的发生，如图4A，4B。 同样，将干扰RNA 进行转染后，炎症因子TNF-α、IL-1β 表达也会有显著性降低（P＜0.01），如图4C，4D。

图4 抑制Agtr1a 蛋白表达对炎症因子的影响Figure 4 Effect of inhibitory Agtr1a protein expression on inflammatory cytokines

2.5 抑制Agtr1a 蛋白表达对p-ERK 蛋白表达的影响

在LPS 刺激下，ERK 蛋白磷酸化显著升高（P＜0.0001），当加入抑制剂氯沙坦后ERK 磷酸化显著性降低（P＜0.01），如图5A。 同样，对原代肝细胞进行转染si-agtr1a 后，ERK 磷酸化也显著性降低（P＜0.001），如图5B。

图5 抑制Agtr1a 蛋白表达对p-ERK 蛋白表达的影响Figure 5 Effect of inhibiting the expression of Agtr1a protein on the expression of p-ERK protein

3 讨论

LPS 是革兰氏阴性菌外膜的主要脂质成分，也是细菌感染的先天免疫反应的主要启动物质［10］。LBP 是一种由肝细胞产生的60 kDa 急性期蛋白［11］。 分布细胞表面，参与识别LPS 的第一个蛋白质是LBP。 LBP-LPS 复合物被转移到CD14 和Toll样受体TLR4 簇，以触发细胞炎症因子的释放，即内毒素血症［12］。 肝作为主要的代谢部位，成为LPS 攻击的重要靶器官，高水平的血清LPS 可引起肝细胞坏死和胆汁淤积，从而导致严重的肝损伤，严重的内毒素血症可并发败血症，导致感染性休克［13］。 血清LBP 浓度升高可作为细菌感染的早期诊断标志。在重症监护室（ICU）收治的成年患者中，血清LBP浓度升高与菌血症或严重败血症和脓毒症休克的发生相关［14］。 临床上通过抗生素治疗影响Toll 样受体反应来调节宿主免疫，从而控制炎症以及增加细菌清除，此种治疗手段杀死细菌的同时会释放细菌来源的壁碎片，这导致了促炎级联的启动，可能会对服用这些抗感染药物的患者造成更严重的伤害［15］。 宋子晨［16］通过敲除LBP，从源头阻断LPS的传播，可显著减低大鼠炎症反应。 另有研究表示在LPS 刺激下，激活循环单核细胞既不需要LBP 也不需要CD14。 目前尚不清楚这些情况下，LPS 刺激信号是通过TLRs 簇受体介导，还是通过另一种尚未识别的途径介导的［17］，同时Minter 等［18］也有相似的发现，也证明了Lbp－／－小鼠和WT 小鼠对照组体内循环细胞因子表达相当，在外源性LPS 递送后，Lbp－／－小鼠和WT 小鼠分离的Kupffer 细胞上，LPS 受体TLR4、CD14 和CD18 的细胞因子表达相当，尚不清楚这是否代表敲除小鼠产生了代偿机制。 目前，在对LBP 蛋白敲除的基础上研究LPS 刺激的炎症反应鲜有报道，因此寻找LBP 敲除后替代LBP 传递LPS 刺激信号的代偿途径，将有助于开发新的治疗方案用于由LPS 诱导引起的内毒素血症。

Agtr1a 作为一种细胞表面的GPCR 蛋白，可以触发G 蛋白独立的第二信使信号，激活许多细胞内蛋白激酶，包括蛋白激酶C（PKC）、丝裂原活化蛋白激酶MAPKs，MAPK 是慢性损伤时被激活的细胞内信号蛋白［19］。 Agtr1a 缺陷小鼠实验中表明AT1a 受体在受损肝中介导MAPK 的激活，介导氧化应激的发展和ERK、c-Jun 的磷酸化。 目前的研究表明AT1a 受体在肝纤维形成中起着重要作用，缺乏AT1a 受体的小鼠对纤维化刺激后炎症和纤维化的发展具有抗性［20］。 另有实验证明阻断AT1 受体，即使用AT1 siRNA 可明显抑制肝癌细胞增殖和炎症反应［21］，Zhao 等［22］利用血管紧张素Ⅱ受体抑制剂氯沙坦改善了由血管紧张素诱导的肝细胞CRP 的表达，降低了肝炎症。 以上实验均表明，Agtr1a 有介导肝损伤的作用，抑制其受体的表达均会对肝损伤有改善。

本研究对Lbp－／－小鼠原代肝细胞进行LPS 刺激时，发现Agtr1a 蛋白的表达量显著上升，在分别加入Agtr1a 抑制剂氯沙坦、si-Agtr1a 后，Agtr1a 蛋白的表达量显著下降，ERK 磷酸化呈现显著性降低，同时与ERK 相关的炎症因子TNF-α、IL-1β 也显著性下降，Agtr1a 在Lbp－／－小鼠原代肝细胞炎症的发生与发展中起着一定的作用，而对野生型小鼠原代肝细胞进行LPS 刺激时，Agtr1a 的表达量并无显著性变化，由此猜想，Agtr1a 通过激活ERK 蛋白的磷酸化从而促使了Lbp－／－小鼠原代肝细胞炎症的发生，Agtr1a 起到代偿LBP 蛋白的作用。 两种抑制方法相比较而言，利用si-Agt1a 有更好的炎症抑制效果，而使用抑制剂氯沙坦既可以抑制炎症也能提高细胞生存率，如Chan 等［23］在急性肝损伤中应用AT1受体抑制剂氯沙坦作为治疗方案，结果表明氯沙坦治疗可以防止急性肝损伤的进展并使得细胞存活率升高、肝酶的减少、肝组织学的得到改善，同时本实验也验证了使用抑制剂氯沙坦不仅可以降低肝细胞炎症，还能提高细胞的存活率，这也许是氯沙坦本身特性，其具体机制还有待探究。 本研究对炎症的降低程度还有待提高，或许还有其他代偿途径需要进一步探索，也许可以通过联合用药的方式来使LPS 诱导的炎症有更大程度的降低，为临床上治疗内毒素血症提供有效的参考。