饲粮添加胆碱对28～70日龄马冈鹅生产性能、屠宰性能、血清生化指标及脂质代谢的影响

邓宇扬 汪 珩 詹育纯 李 烨 谢诗胜 李 胜 王文策 朱勇文* 杨 琳*

(1.华南农业大学动物科学学院广东省动物营养调控重点实验室,广州 510642;2.金钱饲料(东莞)有限公司,东莞 523147)

胆碱又名胆素,最早是Strecker在1849年从动物胆汁中分离得到,广泛分布在植物和动物细胞中,以游离态或复合物的形式存在,如磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱、鞘磷脂或者是卵磷脂[1]。由于胆碱在体内具有作为神经递质乙酰胆碱的前体、细胞膜磷脂的结构成分以及提供甲基等多种功能,是畜禽以及水产动物生长发育必需的维生素[1]。胆碱缺乏时,家禽主要表现为生长速度和饲料转化率下降、易患脂肪肝等[2-3]。饲粮添加胆碱可提高家禽生产性能和营养物质利用率,降低料重比(F/G)[4]。此外,胆碱在调节脂质代谢方面发挥着重要作用。研究表明,在29～48周龄肉种鸡饲粮中添加760 mg/kg胆碱可显著降低肝脏脂质含量和血清甘油三酯(TG)含量[5]。闻治国[6]通过肉鸭平均日增重(ADG)拟合胆碱需要量,推荐1～21日龄北京鸭的饲粮胆碱含量为1 300 mg/kg,而21～42日龄时则是1 150 mg/kg。现今关于胆碱在家禽方面的研究主要集中在鸡、鸭上,而对于肉鹅胆碱需要量的研究相对缺乏。张文旭等[7]综合生长性能、屠宰性能和养分利用率,推荐1～4周龄青农灰鹅饲粮胆碱添加量为1 800 mg/kg。NRC(2004)推荐4～8周龄肉鹅的胆碱需要量为1 000 mg/kg。然而,该数据是借鉴肉鸡的数据得出的,且年代较为久远。因此。本试验以马冈鹅为研究对象,研究不同胆碱添加水平对28～70马冈鹅生长性能、屠宰性能、血清生化与脂质代谢指标及肝脏脂质代谢的影响,以期确定马冈鹅生长中后期饲粮中胆碱的适宜添加水平,为完善我国肉鹅营养需要标准及合理配制马冈鹅饲粮提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲粮配制

选用432只同批出雏、体重相近且健康的28日龄马冈鹅公鹅,采用单因素随机分组试验设计分为6组,以12只试验鹅为1个重复,每组设有6个重复。对照组饲喂不添加胆碱的基础饲粮(胆碱含量为385 mg/kg,离子色谱法测得),其余5个试验组在基础饲粮中分别添加300、600、900、1 200、1 500 mg/kg的胆碱,胆碱是通过等量取代预混料中的膨润土载体加入到基础饲粮中。试验所用基础饲粮以NRC(1994)[8]中的家禽营养需要推荐量为参考,并考虑现今我国马冈鹅生产实际进行配制,为玉米-玉米淀粉-玉米蛋白粉型半纯合饲粮,其组成及营养水平见表1。饲养试验在揭阳市惠来县华南农大·金钱饲料科研合作基地中开展。试验鹅采用笼养方式,自由采食和饮水。试验期为43 d(28～70日龄)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 样品采集与制备

70日龄试验结束时,每个重复选取1只试验鹅,颈静脉采血10 mL,静置30 min后,3 000 r/min离心10 min分离血清,-20 ℃保存,用于血清生化和脂质代谢指标的测定。将采血后的试验鹅屠宰,分离出部分肝脏,放入冻存管并迅速置于液氮,样品保存在-80 ℃冰箱,用于后续肝脏相关指标的测定。剪取 0.1 g肝脏组织,在4 ℃生理盐水中漂洗后用滤纸吸干,称重后加入9倍重量体积的冰生理盐水,利用匀浆机研磨充分,3 000 r/min离心10 min,分离上清液并分装,置于-80 ℃冰箱保存,用于部分肝脏脂质代谢指标的测定。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 生长性能

在28日龄时正式开始试验,试验期间以重复为单位称量、记录各组鹅的耗料重,若有死鹅、病鹅,及时淘汰并记录,在70日龄试验结束时对每一栏舍试验鹅称重,之后计算ADG、平均日采食量(ADFI)和F/G。

1.3.2 屠宰性能

在70日龄试验结束时,从每个重复选取1只试验鹅,颈静脉放血致死,湿法拔毛沥水后称重,测定其屠宰性能,包括屠宰率、半净膛率、全净膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率。试验操作及指标的测定方法参照《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》(NY/T 823—2020)进行。

1.3.3 血清生化与脂质代谢指标以及肝脏脂质代谢指标

参考南京建成生物工程研究所试剂盒操作说明书检测血清、肝脏的如下全部或部分指标:葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性。

肝脏总脂质含量:肝脏总脂质含量的测定参照Folch等[9]的方法,并略有改动。称取肝脏样品1 g左右,加入体积比为2∶1的氯仿-甲醇溶液和50 μL抗氧化剂丁基羟基甲苯,在冰浴下匀浆,静置过滤,滤纸用氯仿-甲醇溶液充分冲洗,然后在滤液中加入10 mL 1.6%的氯化钙(CaCl2),摇匀静置1 h;离心后吸走上清液,将下层液体转入已经称重的容器中,在液氮下干燥至恒重,称重。

肝脏总磷脂含量:将上述脂质重新溶于10 mL氯仿-甲醇溶液中,取4 mL液体,参考Rizki等[10]的操作,采用抗坏血酸-钼蓝比色法测定肝脏总磷脂含量。

1.3.4 肝脏脂质代谢相关基因的表达

依据Trizol法,采用EZB试剂盒从肝脏样品中提取总RNA,然后使用核酸浓度分析仪(ND-2000,Gene Company,美国)测定RNA的浓度,并检测其在260和280 nm处的吸光度比值(OD260 nm/OD280 nm)。按照TaKaRa PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser Kit提供的方法进行逆转录,合成cDNA。

以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因,引物由上海生工生物技术有限公司合成,引物序列见表2。使用Quantifast ST-BR Green PCR Kit,采用SYBR Green Ⅰ染料法,在Bio-Rad CFX-96型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。每个实时荧光定量PCR设2个重复。PCR反应体系为10 μL:SYBR Green Master Mix(2×)5 μL,上、下游引物各0.2 μL,cDNA模板1 μL,ddH2O 3.6 μL。PCR反应程序为:95 ℃预变性10 min,95 ℃变性10 s,56 ℃退火延伸30 s,总计40个循环。反应结束后采用2-ΔΔCt法计算目的基因乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、过氧化物酶增殖物激活受体α(PPARα)和肉碱棕榈酰转移酶1-A(CPT1-A)mRNA相对表达量。

表2 引物序列

1.4 数据统计及分析

数据使用Excel 2013进行初步处理,后续使用SAS 9.2软件对试验数据进行单因素方差分析,差异显著时采用Duncan氏法进行组间多重比较,基因表达所得数据使用Graph Prism 8.0进行柱形图的绘制。试验结果以平均值和均值标准误(SEM)表示,以P<0.05表示差异显著。

2 结 果

2.1 胆碱添加水平对28～70日龄马冈鹅生长性能的影响

由表3可知,胆碱添加水平对28～70日龄马冈鹅的平均末重、ADG和ADFI均没有显著影响(P>0.05);300 mg/kg添加组的F/G显著低于1 200和1 500 mg/kg添加组(P<0.05)。

表3 胆碱添加水平对28～70日龄马冈鹅生长性能的影响

2.2 胆碱添加水平对70日龄马冈鹅屠宰性能的影响

由表4可知,胆碱添加水平对70日龄马冈鹅屠宰率、半净膛率、全净膛率、腿肌率、腹脂率均无显著影响(P>0.05);300 mg/kg添加组的胸肌率显著高于对照组和1 200 mg/kg添加组(P<0.05)。

表4 胆碱添加水平对70日龄马冈鹅屠宰性能的影响

2.3 胆碱添加水平对70日龄马冈鹅血清生化与脂质代谢指标的影响

由表5可知,胆碱添加水平对血清GLU含量、ALT活性无显著影响(P>0.05);300、600、900和1 200 mg/kg添加组血清AST活性显著低于对照组(P<0.05)。对于脂质代谢指标,胆碱添加水平对70日龄马冈鹅血清T-CHO含量无显著影响(P>0.05);900 mg/kg添加组血清TG含量显著低于对照组(P<0.05);600 mg/kg添加组血清HDL-C含量显著高于其余各组(P<0.05);300 mg/kg添加组血清FFA含量显著高于对照组(P<0.05)。

表5 胆碱添加水平对70日龄马冈鹅血清生化与脂质代谢指标的影响

2.4 胆碱添加水平对70日龄马冈鹅肝脏脂质代谢指标的影响

由表6可知,胆碱添加水平对70日龄马冈鹅肝脏总磷脂含量无显著影响(P>0.05);1 500 mg/kg添加组肝脏总脂质含量显著低于对照组和1 200 mg/kg添加组(P<0.05);900 mg/kg添加组肝脏TG含量显著低于除1500mg/kg添加组外的其余各组(P<0.05);300、900 mg/kg添加组肝脏T-CHO含量显著低于1 200 mg/kg添加组(P<0.05);600 mg/kg胆碱添加组肝脏HDL-C含量显著低于对照组和300 mg/kg添加组(P<0.05),而LDL-C含量显著高于对照组和300 mg/kg胆碱组(P<0.05)。

表6 胆碱添加水平对70日龄马冈鹅肝脏脂质代谢指标的影响

2.5 胆碱添加水平对70日龄马冈鹅肝脏脂质代谢相关基因表达的影响

由图1可知,胆碱添加水平对70日龄马冈鹅肝脏中ACC、CPT1-A和PPARαmRNA相对表达量均有显著影响(P<0.05),其中900 mg/kg添加组肝脏ACCmRNA相对表达量显著低于对照组和1 200 mg/kg添加组(P<0.05),PPARαmRNA相对表达量显著高于对照组和300、1 500 mg/kg添加组(P<0.05),而CPT1-AmRNA相对表达量则显著高于其余各组(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 饲粮胆碱添加水平对28～70日龄马冈鹅生长性能和屠宰性能的影响

胆碱能够促进机体生长发育,在猪、反刍动物和水产动物上均已得到了证实[11-13]。Workel等[14]的研究表明,饲粮中添加800 mg/kg胆碱显著提高了肉鸡的ADG,降低了F/G。Rahnama等[15]也得出了相似的结果。蒋雪樱等[16]研究表明,在22～42日龄肉鸡饲粮添加500 mg/kg甜菜碱显著提高了爱拔益加(AA)肉鸡的胸肌和腿肌的重量。本试验结果显示,饲粮添加300 mg/kg胆碱显著降低了28～70日龄马冈鹅的F/G,而胆碱添加水平对28～70日龄马冈鹅的ADG、ADFI和平均末重均无显著影响。在屠宰性能方面,本试验发现胆碱添加水平对70日龄马冈鹅的屠宰率、半净膛率和全净膛率均无显著影响。而张文旭等[7]的研究发现,在15周龄青农灰鹅饲粮中添加1 800 mg/kg胆碱能够显著提高肉鹅的屠宰率和全净膛率,与本试验结果不一致,这可能是鹅的品种与生长阶段不同所导致。此外,添加300 mg/kg胆碱显著提高了70日龄马冈鹅的胸肌率,与蒋雪樱等[16]的结果一致,这可能是由于胆碱在体内为蛋氨酸合成提供甲基,并提高了其有效利用率,使马冈鹅生长速度加快,提高了蛋白质的周转沉积[17]。

3.2 饲粮胆碱添加水平对70日龄马冈鹅血清生化与脂质代谢指标以及肝脏脂质代谢的影响

AST、ALT与动物肝脏功能密切相关,其活性可反映肝脏功能是否正常[18]。当肝脏功能衰退时,ALT和AST进入血液中增加,血液中这2种酶的活性也随之升高。因此,肝脏功能正常与否与可以通过测定血液中AST和ALT的活性进行评估。而肝脏出现脂肪性病变时,脂质增加会导致血糖水平升高[19]。本试验中,饲粮添加胆碱可降低血清AST活性,表明胆碱可能对肝脏功能有一定的改善作用。Yusuf等[20]在21～42日龄肉鸡饲粮中添加3 g/kg甜菜碱也得出同样的结果。在北京鸭的研究也表明,胆碱缺乏显著提高了血清中AST和ALT的活性,而对GLU含量无显著影响[6]。TG、T-CHO、LDL-C和HDL-C是体内脂质水平的重要标志,其含量反映了体内脂质的吸收和代谢。HDL-C能促进肝外胆固醇转运到肝脏代谢,维持胆固醇稳定,而LDL-C是TG的主要运输者,禽类脂肪沉积主要取决于血清TG含量。闻治国[6]的研究表明,饲粮胆碱含量对21日龄北京鸭血清T-CHO和HDL-C含量无显著影响,而饲粮胆碱含量为1 414 mg/kg时显著提高了血清FFA和LDL-C含量。Song等[21]研究表明,饲粮添加2 955 mg/kg胆碱显著升高了蛋鸭血清高密度脂蛋白(HDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和TG含量。本试验中,饲粮胆碱添加水平对70日龄马冈鹅血清T-CHO含量无显著影响,600 mg/kg胆碱添加水平显著降低了血清TG含量,300 mg/kg胆碱添加水平显著提高了血清HDL-C和FFA含量,这与前人研究结果大致相同。血清中TG和T-CHO含量下降说明机体脂肪分解代谢增强,这与本试验前文关于腹脂率降低的研究结果一致。

肝脏是脂质代谢的主要场所,在调节脂质代谢和维持机体脂质稳定方面有着重要作用[22]。肝脏总脂质和TG含量随饲粮胆碱添加水平的升高呈现逐渐下降的趋势,这在小鼠[10]和肉鸡[23]的研究中己经证实。本试验结果表明,添加900 mg/kg胆碱显著降低了70日龄马冈鹅肝脏中TG含量,而添加600 mg/kg胆碱显著降低了肝脏HDL-C含量和升高了肝脏LDL-C含量。这可能是因为胆碱磷酸化促进了肝脏中VLDL和HDL的合成,VLDL从脂肪组织和脂蛋白中动员TG以降低血清TG含量。TG的降解增加了血清FFA的含量。此外,HDL与胆固醇结合形成HDL-C,降低T-CHO含量,从而减少或重新分配体内脂肪。

除FFA和TG摄取外,肝脏脂质代谢还涉及脂肪酸的从头合成和氧化。ACC是催化脂肪酸合成反应的限速酶,调控脂肪合成[22],CPT1-A和PPARα在脂肪酸β氧化中起关键作用,前者是该过程的关键酶,后者则是促进脂肪酸β氧化的靶基因[23]。本试验结果表明,对照组肝脏中ACCmRNA相对表达量显著高于1 200 mg/kg添加组,与El Sayed等[24]和姚宏等[25]分别在肉鸭和肉鸡上报道的甜菜碱能降低肝脏ACC基因表达的结果一致。由此可知,胆碱通过下调ACC的表达抑制机体脂肪合成。随着饲粮中胆碱添加水平的增加,肝脏中PPARαmRNA相对表达量呈现先增加后下降的趋势,且900 mg/kg添加组肝脏中PPARαmRNA相对表达量显著高于对照组和300、1 500 mg/kg添加组。而900 mg/kg添加组肝脏中CPT1-AmRNA相对表达量显著高于各组。张彩霞[26]报道,饲粮中添加0.06%胆碱显著提高了獭兔肝脏中CPT1-AmRNA相对表达量。PPARα和CPT1-A的表达上调可促进脂肪酸氧化反应,降低肝脏TG和胆固醇含量,调节脂质代谢。研究表明,胆碱代谢产生甲基供体可通过降低PPARα启动子甲基化上调PPARα及其靶基因CPT1-A表达,降低肝脏TG累积[27]。

4 结 论

本试验条件下,在玉米-玉米淀粉-玉米蛋白粉型半纯合饲粮(胆碱含量385 mg/kg)中添加300 mg/kg胆碱可降低28～70日龄的马冈鹅F/G,提高70日龄马冈鹅的胸肌率;添加900 mg/kg胆碱可降低70日龄马冈鹅血清和肝脏中TG含量,提高肝脏中PPARα和CPT1-AmRNA相对表达量。若考虑生产性能,建议28～70日龄马冈鹅饲粮中胆碱添加量为300 mg/kg(实际含量为685 mg/kg)。