加味大黄附子汤调节Wnt/β-catenin信号通路保护慢性肾脏病小鼠认知功能的机制

孔文文,巴元明

(1.湖北中医药大学,湖北 武汉 430070;2.湖北省中医院肾病科,湖北 武汉 430060)

慢性肾脏病已成为全球性公共健康问题,其发病率和病死率均较高,且大多难以根治,临床治疗以控制并发症和延缓疾病进展为宗旨[1]。研究[2-3]发现,部分慢性肾脏病患者进入透析前已出现不同程度的认知功能障碍。目前,慢性肾脏病发生认知功能障碍的机制尚未阐明,临床治疗药物也处于探索阶段。中医相关研究[4]认为,慢性肾脏病病程漫长,气血运转异常形成痰湿、血瘀、浊毒等,从而引起脑损伤、神经侵犯、认知功能障碍等病理产物。加味大黄附子汤由《金匮要略》中记载的大黄附子汤演变而来,具有健脾温肾、通腑泄浊之效,临床用于慢性肾脏病可有效改善患者肾功能[5-6]。Gu等[7]研究显示,慢性肾脏病-认知障碍模型中,加味大黄附子汤可改善小鼠认知功能,可能与抑制AhR/NF-κB/JNK信号通路有关。相关研究[8]表明,Wnt/β-环形蛋白(β-catenin)信号通路与神经退行性疾病的发病关系密切。加味大黄附子汤改善慢性肾脏病-认知障碍的作用机制仍有待深入分析。本研究拟从Wnt/β-catenin信号通路角度,分析加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠的认知功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

65只雄性C57BL/6小鼠,SPF级别,体质量18～22 g,8～12周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,实验生产动物合格证号:SCXK(京)2020-0006。小鼠均分笼饲养,动物房内设置温度23～25℃,相对适度40%～60%,自由摄食饮水,适应性喂养1周后进入后续实验。

1.2 药物与主要试剂

加味大黄附子汤:附子10 g,大黄30 g,牡蛎40 g,苦参、蒲公英、山参各30 g,准确称取各味药,水浸泡30 min,大火煮开,再小火煎煮30 min,过滤收集滤液170 mL(生药浓度为1 g/mL),调节pH至7.0,过滤除菌后置于4 ℃冰箱保存备用[7]。0.2%腺嘌呤饲料及普通饲料(南通特洛菲饲料科技公司),Wnt/β-catenin信号通路抑制剂(IWR-I,美国MCE公司),苏木精-伊红染液(北京索莱宝科技公司),肌酐、尿素氮、乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所),Wnt3a、β-catenin、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(美国Abcam)。

1.3 动物分组及模型构建

65只小鼠随机选取10只作对照组(普通饲料喂养),剩余55只采用0.2%腺嘌呤饲料喂养5周建立慢性肾脏病模型,随机取2只小鼠处死,取出肾组织,可观察到肾脏体积缩小、色泽苍白、表面有颗粒物,可见肾小球萎缩、间质纤维化等典型病理学改变,即可判定建模成功,剩余建模成功小鼠随机分为模型组、加味大黄附子汤低、中、高剂量组、加味大黄附子汤高剂量+Wnt/β-环形蛋白(β-catenin)信号通路抑制剂(IWR-I)组,每组各10只。造模36 d,所有组小鼠均给予普通饲料,加味大黄附子汤低、中、高剂量组分别灌胃8、16、24 g/kg加味大黄附子汤[7],加味大黄附子汤+IWR-I组灌胃24 g/kg加味大黄附子汤+腹腔注射5 mg/kg IWR-I,对照组和模型组予以同剂量生理盐水。见图1。

1.4 Morris水迷宫试验

给药结束后,采用Morris水迷宫实验系统(上海吉量软件科技公司)评估小鼠认知功能,包括定位航行实验(第1～5天)和空间探索实验(第6天),定位航行实验:直径120 mm的圆柱体内倒入22 ℃无毒白色颜料,水池顺时针分为4个象限,将平台放置于第二象限中央位置,池水没过台面,将小鼠面朝池壁方向任一象限放入,记录小鼠自下水至找到平台所需时间,即为逃避潜伏期,若60 s内仍未找到平台,则逃避潜伏期记录为60 s,连续训练5 d。空间探索实验:第6天撤去平台,将小鼠面朝池壁方向任一象限放入,记录小鼠60 d内穿越原平台处的次数。

1.5 血清肌酐、尿素氮、乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)水平检测

完成Morris水迷宫试验后,夜间禁食,次日眼眶取血,3 000 r/m离心10 min,分离血清,于-20 ℃冰箱保存待测。参照试剂盒说明书操作,检测血清肌酐、尿素氮、AChE和ChAT水平。

1.6 HE染色

眼眶取血后以颈椎脱臼法处死小鼠,快速取出肾脏和脑组织,肾脏组织和部分脑组织浸于4%多聚甲醛溶液中固定过夜,制备厚度为4 μm石蜡组织切片,行常规HE染色,光镜下进行病理学观察,剩余脑组织置于液氮冻存待测。

1.7 Western blot法检测脑组织Wnt3a、β-catenin蛋白表达

取出冻存脑组织,RIPA裂解液匀浆,12 000 r/m离心10 min,提取总蛋白,测定蛋白浓度后,各组取等量(30～50 μg)蛋白进行10% SDS-PAGE凝胶电泳,再将蛋白条带电转至PVDF膜,封闭2 h,分别浸于稀释比1∶1 000的Wnt3a、β-catenin、β-actin抗体,4 ℃下孵育过夜,次日浸于稀释比1∶8 000的蛋白二抗,室温下孵育1 h,最后滴加ECL发光试剂,用X光胶片暗盒(北京吉田生物科技公司)曝光、显影,应用Image J v1.8.0软件测定目标条带灰度值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠认知功能的影响

与对照组比较,模型组小鼠第2～5天逃避潜伏期升高,穿越平台次数减少(P<0.05);与模型组比较,中、高剂量组第3～5天逃避潜伏期降低,穿越平台次数增加(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+IWR-I组第2～5天逃避潜伏期升高,穿越平台次数减少(P<0.05)。见表1。

表1 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠认知功能的影响

2.2 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠血清肌酐和尿素氮水平的影响

与对照组比较,模型组小鼠血清肌酐和尿素氮水平升高(P<0.05);与模型组比较,中、高剂量组肌酐和尿素氮水平均降低(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+IWR-I组肌酐和尿素氮水平均升高(P<0.05)。见表2。

表2 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠血清肌酐和尿素氮水平的影响

2.3 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠血清AChE和ChAT水平的影响

与对照组比较,模型组小鼠血清AChE水平升高,ChAT水平降低(P<0.05);与模型组比较,中、高剂量组AChE水平均降低,ChAT水平均升高(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+IWR-I组AChE水平升高,ChAT水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠血清AChE和ChAT水平的影响

2.4 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠肾脏及脑组织病理学形态的影响

与对照组比较,模型组小鼠肾组织出现明显的肾小球结构紊乱,肾小管管腔增大,间质纤维化、炎性细胞浸润显著,脑组织海马CA1区细胞排列不规则且稀疏,细胞层次减少;与模型组比较,中、高剂量组上述病理损伤有所减轻;与高剂量组比较,高剂量+IWR-I组病理损伤加重。见图1。

2.5 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠Wnt/β-catenin信号通路表达的影响

与对照组比较,模型组小鼠脑组织中Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,中、高剂量组Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平升高(P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+IWR-I组Wnt3a、β-catenin蛋白表达水平降低(P<0.05)。见图2及表4。

表4 加味大黄附子汤对慢性肾脏病小鼠Wnt/β-catenin信号通路表达的影响

3 讨论

近年来,中医药防治慢性肾脏病及认知功能障碍方面的研究已成为热点。中医并没有认知功能障碍这一病名,可归为“呆病”“脑病”“髓消”等范畴,其发病与肾精不足、浊瘀阻窍有关;而慢性肾脏病在中医中属于“虚劳”“水肿”等病,病机为脾肾虚亏、湿停瘀阻;可见慢性肾脏病与认知功能障碍的病机均与肾精关系密切[9-10]。加味大黄附子汤方中附子可回阳救逆、补火助阳,大黄性寒,具有清热泻火、巩逐积滞、祛瘀活血之效,牡蛎可净化瘀血、收敛解毒,苦参、蒲公英具有清热解毒、燥湿利尿的功效,山参大补元气、生津安神,诸药合用攻补兼施,切中病机[11-12]。

目前,慢性肾脏病动物模型的制备方法较多,均存在一定的局限性,其中手术操作稍复杂,容易出现术后感染、死亡;尾静脉注射阿霉素,破坏肾小球结构,引起肾功能进行恶化,但与中医病因病机学说不符[13-14]。本研究采用0.2%腺嘌呤饲料诱导慢性肾脏病动物模型,腺嘌呤进入动物体内后,其代谢产物达到肾脏造成肾损伤,造成肾功能减退,更符合人类慢性肾脏病的发生发展过程。结果显示,与对照组比较,模型组小鼠肾组织肾小球结构紊乱,肾功能指标升高,同时伴有认知功能减弱,脑组织海马CA1区细胞排列不规则且稀疏,细胞层次减少,胆碱能神经功能减弱。加味大黄附子汤在改善模型小鼠肾功能和认知功能方面发挥了良好效果,与既往研究[7]结果相符。

Wnt信号广泛存在于各生物体,与多种疾病发病相关,其中Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号中的经典通路,通路激活时,Wnt蛋白被分泌至细胞外,与细胞膜上的跨膜受体结合引起Wnt/β-catenin通路的活化,β-catenin进入细胞核影响下游基因表达[15-16]。大量研究[17-18]表明,Wnt/β-catenin信号通路在认知功能障碍中发挥至关重要的作用:Mohamed等[17]报道,调节Wnt/β-catenin信号通路活性,可改善慢性应激诱导的认知缺陷。Wang等[18]研究发现,激活Wnt/β-catenin信号通路可缓解淀粉样蛋白β引起的血脑屏障功能障碍,可能是治疗阿尔茨海默症的潜在靶向通路。本研究显示,慢性肾脏病小鼠脑组织Wnt/β-catenin信号通路处于“沉默”状态,加味大黄附子汤可激活Wnt/β-catenin信号通路,改善中枢胆碱能系统反应,提升小鼠认知水平,而且添加Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-I后可逆转加味大黄附子汤效果,反向验证Wnt/β-catenin信号通路是加味大黄附子汤改善慢性肾脏病小鼠认知功能的作用机制。

综上,加味大黄附子汤可改善慢性肾脏病小鼠认知功能,其作用可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究的浓度范围内,16、24 g/kg加味大黄附子汤指标改善效果更佳,后期研究将从拆方及组分方面深入分析加味大黄附子汤与慢性肾脏病认知功能障碍的关系。