三叶青查尔酮异构酶基因的克隆及序列分析

邓思珊 刘洪旭 马丽红

福建省医学科学研究院 福建省医学测试重点实验室，福建福州 350001

黄酮类化合物是植物在长期的进化过程中为适应生态环境或抵御外界侵袭而形成的一大类次生代谢产物，在长期的生态适应过程中发挥重要作用。查尔酮异构酶（chalcone-flavonoid isomerase，CFI）能够催化查尔酮分子内环化反应，生成（2s）-黄烷酮，是植物体内催化黄酮类成分生物合成的第二个关键酶，CFI基因表达量与黄酮合成量密切相关[1]。

有关CFI研究非常广泛，在山葡萄、草莓、白木香、盐肤木、光果甘草、红花、紫丁香等多种植物中都报道了该酶基因序列[2-8]。三叶青来源于葡萄科崖爬藤属植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiel et Gilg）的干燥全草，是福建、浙江地区传统习用青草药[9]，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效，被称为天然抗生素。现代医学表明三叶青有较强的抗炎、抗病毒、抗肿瘤作用[10-11]。实验证实三叶青中含大量以异荭草素、荭草素、牡荆素、异牡荆素等系列为主的碳苷黄酮化合物[12]，碳苷黄酮是一类具有更强抗肿瘤活性的化合物[13]，为阐明三叶青中CFI的结构基因信息及其在黄酮生物合成途径中表达调控机制，本研究基于转录组数据的生物信息学，设计筛选出一批与黄酮生物合成相关的关键基因，根据转录组筛选的多个基因序列设计引物，进行反转录PCR，获得多个产物，经过克隆及测序，首次成功鉴定出1条与其他植物中查尔酮-异构酶具有高度同源序列的三叶青CFI。为后期利用基因工程菌株干预诱导CFI基因增加碳苷黄酮化合物的合成量，从而进一步增强三叶青抗肿瘤活性奠定基础。

1 材料

三叶青药材采自福州集珍园生物科技有限公司宁化县水茜镇三叶青种植基地，选择主要优选品种闽选1号（MX1），经福建省医学科学研究院刘洪旭研究员鉴定为葡萄科植物三叶崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）。新 鲜 叶 片及时用液氮在研钵中充分研磨后带回实验室保存在-80℃冰箱中用于提取总RNA。

植物总RNA提取试剂盒、逆转录试剂、PCR试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，克隆载体pMD18-T及大肠杆菌DH5a购自大连宝生物科技有限公司。转录组测序由上海美吉生物科技有限公司完成，引物的合成和产物测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2 方法

2.1 转录组测序及数据分析

三叶青样品用干冰送至上海美吉生物科技有限公司进行转录组测序。基于课题组前期研究结果和转录组数据分析三叶青转录组测序数据，提取到CFI的相关序列。

2.2 三叶青总 RNA提取及逆转录PCR

取三叶青样品，液氮中充分研磨后，按植物总RNA提取试剂盒说明进行操作。以所提的总RNA为模板，以oligo（dT16）及随机引物（N8）作为引物进行逆转录反应。以逆转录产物为模板，使用正向引物CFI-F（5’-CCTTTCTCTGCATCAGTTTCCC-3’）与反向引物CFI-R（5’CACCATAAAAGTCAATACTCTCCC-3’）进行PCR，扩增片段CFI-ORF。

2.3 分子克隆及测序

将CFI的PCR扩增产物经回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接并转化至大肠杆菌DH5a。筛选的阳性克隆菌送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

2.4 MX1-CFI开放阅读框序列分析及基于氨基酸序列的系统发育分析

使用BioEdit软件对根据MX1-CFI的开放阅读进行氨基酸翻译；使用PhyloSuite 2.1[14]中的MAFFT算法对13个植物CFI基因的氨基酸序列进行多重序列比对并通过在服务器Esprit 3.0（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）进行美化；系统发育分析采用最大似然法（maximum likelihood，ML）进行，用于系统发育分析的数据集最适进化模型使用ModelFinder[15]基于BIC标准进行，模型为JTTDCMut+G4，各分支的可靠性根据10 000次超快自举法（ultrafast bootstrapping）进行评估。

3 结果与生物信息学分析

3.1 CFI基因扩增及测序

使用正向引物CFI-F与反向引物CFI-R对反转录产物进行PCR，扩增获得MX-CFI片段。琼脂糖凝胶电泳图（图1）显示，PCR产物的长度与转录组分析的数据相符。测序结果经过NCBI数据库BLAST搜索比对分析，确认该扩增产物为具有完整ORF框的CFI基因，其序列长度为714 bp，编码237个氨基酸（图2）。NCBI登录号为OP358477。

图1 三叶青PCR产物的琼脂糖凝胶电泳

图2 根据遗传密码子分析的MX1-CFI氨基酸序列

3.2 三叶青CFI同源氨基酸序列比对及二维结构分析

通过NCBI数据库获取12个与MX-CFI氨基酸序列高度同源的其他植物CFI。使用软件MEGA[16]及Esprit 3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）进行多重序列比对与修饰。分析显示，13个CFI均能形成紧密的二维结构，含有多达89个氨基酸参与形成7个α螺旋；多达60个氨基酸参与形成11个β折叠（图3）。高度保守的氨基酸序列与高密度二维结构可能是该基因产物执行查尔酮异构酶功能的必需特征。

图3 包含三叶青MX1-CFI在内的13个植物CFI的氨基酸序列多重比对

3.3 基于CFI同源氨基酸序列同源性的系统进化分析

基于CFI基因重建的系统发育树（图4）所示，13个植物的CFI基因在进化上可以聚为两大簇，其中三叶青优先与大齿牛果藤（GenBank 登录号KC753776）相聚成簇，随后与山葡萄（GenBank登 录 号KT314072）、河 岸 葡 萄（GenBank 登 录 号XP034703680）、酿酒葡萄（GenBank 登录号RVX13902）和唇葡萄（GenBank 登录号ACS36662）聚为一大簇，其他7种植物聚为另一大簇，表明三叶青的CFI基因在进化上与大齿牛果藤的亲缘关系最近。

图4 13个植物CFI的系统发育树

4 讨论

本研究中的三叶青中查尔酮异构酶生物学信息可为研究三叶青CFI在黄酮类生物合成过程中的重要性提供参考。例如，三叶青的多个品种间是否也在CFI的氨基酸序列与基因表达量上存在差异，CFI氨基酸序列差异明显的三叶青品种内黄酮含量是否存在明显差异，CFI表达量在时空上的变化能否作为三叶青黄酮积累的标记特征。还可通过比较三叶青多个品种的黄酮含量与CFI氨基酸序列差异间的相关性，建立类似于条形码的分子标记来区分三叶青品种间的遗传进化关系，以评估三叶青品种的药用价值。

目前三叶青药用部位主要还是地下块根[17-18]，块根生长周期较长，作为藤本植物，三叶青地上部分产量较高，有较高的经济价值，而黄酮主要存在叶片中，因此对三叶青CFI基因信息的分析，可为今后通过生物技术进一步提高黄酮类功效物质在三叶青叶中的量奠定了基础。

系统发育分析采用ML法，进化生物学认为，在进化模型确定的情况下，ML法是与进化事实吻合最好的建树算法[19]。三叶青与大齿牛果藤均属于葡萄科崖爬藤属藤本植物，山葡萄、河岸葡萄、酿酒葡萄和唇葡萄则属于葡萄科葡萄属藤本植物，基于ML法重建的系统发育树显示CFI基因在进化上具有较强的寄主特异性，分析结果与植物自身形态差异及植物分类学是相一致，说明CFI基因在植物遗传进化过程中具有一定的保守性与标记性。因此，CFI可以作为一种特异性基因来描述不同植物间的差异，是植物多样性的一种分子标记。

本研究存在一定客观的局限性，CFI基因是黄酮类成分合成的上游基因，三叶青中黄酮的合成过程多个关键基因特别是形成碳苷黄酮的关键基因如糖基转移酶、加氧酶、羟化酶等还待挖掘验证，碳苷黄酮累积量与哪些关键基因密切相关都还需要进一步深入研究。在今后的研究中，可结合黄酮含量及各基因表达量，找出其中关联密切的基因，为今后活性成分合成及调控机制研究提供更全面信息。