烟稻轮作条件下有机肥施用时期对烤烟碳氮代谢的影响

高静娟， 朱晨宇， 柯玉琴， 郑朝元， 李春英， 李文卿*

（1.福建农林大学资源与环境学院国际镁营养研究所，福州 350002； 2.福建农林大学生命科学学院，福州 350002； 3.福建省烟草专卖局烟草科学研究所，福州 350013）

碳氮代谢是烤烟最基本的代谢过程，在植物生长发育中起着关键作用[1]，与烟叶品质形成密切相关[2]。在烟叶生长发育和成熟过程中，只有碳氮代谢平衡协调，才能生产出优质烟叶。烟株叶绿体色素含量、光合特性、荧光特性以及碳氮代谢关键酶活性是衡量碳氮代谢过程是否平衡的关键指标，研究碳氮代谢对烟叶品质形成的影响有重要意义。

烤烟碳氮代谢过程在很大程度上受到施肥处理的影响[3]，碳氮代谢平衡与施肥的种类、用量等密切相关[4-5]。吴飞跃等[6]研究表明，有机肥的施用能增强总糖、总氮积累能力，降低烟碱含量，对中部叶碳氮代谢影响较大；王树会等[7]研究表明，增施草炭可以在一定程度上促进烟株生长，提高烟叶产量、降低烟叶淀粉含量、改善烟叶品质，且与草炭用量呈负相关；王林虹等[8]研究表明生物炭可以改善烟叶品质；肖艳松等[9]发现，增施有机肥能促进烟叶生长发育，延长大田生育期，提高中、上部叶耐熟性，改善烟叶化学成分的协调性，提高上等烟比例，从而提高烟叶产值。

大量的化肥施用已不能有效地提高烟叶品质[10]，且存在肥料浪费和一定的环境问题[11]。近年来，福建烤烟生产中较为重视稻草回田和有机肥施用，可起到改善土壤微生物群落结构[12-13]、提高土壤质量的作用[14]。福建烟区为烟-稻轮作模式，生产中一般只关注烤烟当季施肥对烤烟生产的影响，水稻季施肥对烤烟生产影响的相关研究未见报道。另外，南方春烟区烤烟生长后期常遇高温和强光天气而导致烟叶高温逼熟，影响烟叶烘烤特性，对上部叶烘烤质量产生较大负面影响。鉴于此，本研究通过2 年定位试验，研究了烤烟季和水稻季分别施用饼肥对烤烟生长生理特性的影响，旨在为烟稻轮作区养分管理和烤烟生长后期烟叶养熟管理措施的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

烤烟品种为福建省主栽品种‘翠碧一号’（CB-1），种子为包衣种子，由三明市烟草公司提供。试验所用化肥和饼肥均由三明金明农资有限公司提供。

1.2 试验方法

试验在福建省烟草科学研究所福州宦溪科研基地进行。试验于2017 年烤烟采收结束后水稻季开始，2019 年烤烟生产季测定烤烟生理指标。2017年晚稻收割后，按梅花5点取耕作层（约0—20 cm）土样，过1 cm 筛后，混合均匀，四分法留1.5 kg 样品，风干，测定其养分含量；2018 年水稻收割后，每小区按照相同方法取样，测定土壤养分含量。2017 年基础土壤和2019 年栽烟前土壤养分状况见表1。

表1 试验田土壤肥力状况Table 1 Status of soil fertility in test plot

试验设计4个施肥处理。①烤烟季，纯化肥施用，施氮量为97.5 kg·hm-2；水稻季，纯化肥施用，施纯氮126 kg·hm-（2T1处理）。②烤烟季，化肥+饼肥处理，化肥氮施用为97.5 kg·hm-2，移栽时施用5 625 kg·hm-2饼肥；水稻季，纯化肥施用，施纯氮126 kg·hm-（2T2处理）。③烤烟季，纯化肥施用，施氮量为97.5 kg·hm-2；水稻季，化肥+饼肥处理，施化肥纯氮126 kg·hm-2，移栽时施用5 625 kg·hm-2饼肥（T3 处理）。④烤烟季，化肥+饼肥处理，施化肥氮量为97.5 kg·hm-2，移栽时施用5 625 kg·hm-2饼肥；水稻季，化肥+饼肥处理，施化肥纯氮126 kg·hm-2，移栽时施用375 kg·hm-2饼肥（T4处理）。

各小区面积266.67 m2，不设重复。烤烟季施用化肥氮97.5 kg·hm-2，N∶P2O5∶K2O均为1∶0.8∶2.8；水稻季施用化肥氮126 kg·hm-2，N∶P2O5∶K2O 均为1∶0.59∶0.27；饼肥N、P2O5和K2O 含量分别为6.45%、2.70%和1.71%。在每年晚稻收割后将所有稻草粉碎后均匀撒回田间，灌水溶田，移栽前1 个月左右排水，晒干后起垄。烤烟肥料种类为专用肥、饼肥、钙镁磷肥和复合肥；水稻季肥料种类为碳铵、饼肥、过磷酸钙、尿素和复合肥。烟株于1 月25 日移栽，4 月5 日团棵，5 月16 日开始采收。田间管理同目前生产上优质烟生产方法。

1.3 测定方法

2019年6月11日对烤烟上2棚叶采收时进行取样，每处理取4 株烟株的倒2、倒3 叶片带回实验室，剔除主脉并剪碎混匀后，测定各生理指标。

1.3.1 叶绿体色素测定 采用Arnon 法[15]测定叶绿体色素含量：称叶圆片0.15 g置于25 mL容量瓶中，用80%丙酮定容，置于暗处浸提24～48 h，其间振荡数次，待叶片完全发白、色素全部溶于丙酮溶液后，用UV-2601紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）分别测定470、646 和663 nm 处的OD 值，计算叶绿素a（chlorophyll a）、叶绿素b(chlorophyll b)、总叶绿素（chlorophyll）和类胡萝卜素（carotenoids）的含量，重复3次取平均值。

1.3.2 光合参数测定 在取样前用CIRAS-Ⅱ型（英国PP-system 公司）便携式光合仪测定光合参数。仪器叶室类型为直径18 mm 的圆形叶室，测定叶面积2.5 cm2，叶室温度为25 ℃，设定LED 内置光照强度1 000 μmol·m-2·s-1，大气环境作为CO2源。设置好参数后用叶室探头夹住烟株最上部完全展开叶进行测定，指标包括净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、气孔导度(stomatal conductance，Gs)、蒸腾速率(transpiration rate，Tr) 和胞间CO2浓度(intercellular CO2concentration，Ci)，待测定指标数据稳定后进行数据保存，每组重复测定5株叶片，计算平均值。

1.3.3 荧光参数测定 采用荧光仪（Pocket PEA,Hansatech,英国）测定，利用暗适应夹暗处理待测叶片30 min，将暗适应夹连接上光合仪探头进行测定，每组重复测定5株叶片，计算平均值。

初始荧光（initial fluorescence，Fo）表示PSⅡ反应中心全部开放时即原初电子受体全部氧化时的荧光水平，理论上用来指反应中心未能发生光化学反应时的叶绿素荧光。可变荧光（variable fluorescence，Fv）反映可参与PSⅡ光化学反应的光能辐射部分，黑暗中最大可变荧光强度反映了辅酶A的还原情况。最大荧光（maximal fluorescent，Fm），是已经暗适应的光合机构全部PSⅡ中心都关闭时的荧光强度，这时所有的非光化学过程都最小，这是标准的最大荧光，可反映PSⅡ电子传递情况，Fm=Fv+Fo。 最大光化学效率（maximum photochemical efficiency，Fv/Fm）代表PSⅡ光化学的最大效率或PSⅡ原初光能转化效率，常与光抑制程度相关，在正常条件下，该值范围在0.80～0.84，该值越高，反映植物受到光抑制的程度越低。Fv/Fo反映潜在光化学活性（potential photochemical efficiency）的高低，常用来度量PSⅡ的潜在光化学效率，常用于度量PSⅡ的潜在活性。

1.3.4 酶活性测定 采用上海通蔚实业有限公司研发的植物二磷酸核酮糖羧化酶（Ribulose bisphosphate carboxylase，RuBPCase）酶联免疫分析(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒测定，以每毫克蛋白中二磷酸核酮糖羧化酶含量(ng)定义为1 个酶活力单位（1U）。硝酸还原酶（nitrate reductase, NR）的活性参照邹琦[15]的方法测定，以每克植物鲜重每小时产生亚硝态氮量(μg)为1 个酶活力单位（1U）。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性参照邹琦[15]的方法测定，以每毫克蛋白每小时在540 nm 处消光值变化1 定义为1 个酶活力单位（1U）。蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）和蔗糖合成酶（sucrose synthetase，SS）活性测定参照赵越等[16]方法，以每毫克蛋白每分钟产生蔗糖量(μg)为1个酶活力单位（1U）。

1.4 数据分析

利用SPSS 软件进行数据的统计分析，以Duncan’s 法比较不同处理间差异显著性，利用Excel软件进行平均值的计算及图表绘制。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对烟株生长的影响

从图1 可见，T1 处理长势最弱，株型较小，且烟株叶片严重发黄，表现脱肥。T3 处理烟株长势略好于T1处理，但明显弱于T2和T4处理，株型相对较小，这可能是由于水稻季施用的有机肥残留为烟株提供了一定的养分。T2 和T4 处理烟株长势都较好，没有明显的差异，这可能是烤烟当季增施有机肥可以更好地满足烟株的生长发育。

图1 不同处理下烟株长势Fig. 1 Plant growth of tobacco under different treatments

2.2 不同处理对烟株叶绿体色素含量的影响

从表2 可见，不同处理叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素含量变化规律一致，均表现为T4＞T2＞T3＞T1。其中，烟稻2 季均为化肥和有机肥配施处理（T4 处理）的烟株叶绿素a、总叶绿素和类胡萝卜素含量均显著高于其他处理，叶绿素b 含量T4 与T2 处理差异不显著，但显著高于T1和T3 处理，后两者之间叶绿素b 含量差异不显著；T2 和T3 处理的总叶绿素含量和叶绿素a 含量差异不显著，但均显著高于纯施化肥的T1 处理；类胡萝卜素含量在4 个处理间均表现为显著差异。虽然烤烟季施肥T1 处理和T3 处理一样，T2处理和T4处理一样，但各叶绿体色素含量却均表现为T3＞T1、T4＞T2，说明T3、T4 处理水稻季施用有机肥可以促进烟株叶绿体色素含量提高，即水稻季施用有机肥的肥效可持续到烤烟季。而T2和T3处理一年中有机肥施用量相同，但类胡萝卜素含量却表现为T2＞T3，说明其有机肥肥效主要在当季释放。

表2 不同处理下烟株叶绿体色素含量Table 2 Chloroplast pigment content of tobacco plant under different treatments

2.3 不同处理对烟株光合特性的影响

从表3 可见，烤烟的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)均在T4 处理时最大，T1 处理时最小，整体表现为T4＞T2、T3＞T1；而胞间CO2浓度(Ci)为T4 处理时最小，T1 处理时最大。净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)均表现为T2＞T3，表明有机肥施用在烤烟季能更有效地促进烤烟光合作用。由此可见，当季有机肥的施用能有效增强烤烟净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)，从而在一定程度上增强叶片的光合作用，增加烤烟干物质的积累。

表3 不同处理下烟株光合特性Table 3 Photosynthetic characteristics of tobacco plant under different treatments

2.4 不同处理对烟株荧光特性的影响

由表4 可知，T3 处理的初始荧光（Fo）最高，显著高于T1和T2处理；T4处理最大荧光（Fm）最高，显著高于T1 和T2 处理，且T2 处理显著高于T1处理；各处理可变荧光（Fv）由大到小依次为T4＞T2＞T3＞T1，且T4 处理显著高于T1 处理，说明T4 处理烟株叶片PS Ⅱ活性最大。最大光化学效率（Fv/Fm）表现为T1 处理显著低于其他处理，表明T1 处理的抗逆性较弱； T4 处理PSⅡ潜在光化学效率（Fv/Fo）最大且显著高于T1、T2 处理，表明T4处理对环境有更强的适应性。

表4 不同处理下烟株叶绿素荧光参数Table 4 Fluorescence characteristics of tobacco plant under different treatments

2.5 不同处理对烟株核酮糖二磷酸羧化酶活性的影响

从图2 可见，T4 处理二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPCase）活性最高，显著高于T1 处理，T2、T3处理RuBPCase 活性高于T1 处理，但二者差异不显著。说明烟稻2 季均化肥和有机肥配施能更好地提高烤烟RuBPCase活性，仅水稻季配施有机肥能在一定程度上提高第2 年烤烟RuBPCase 活性，但没有仅烤烟季施用有机肥提高效果明显。

图2 不同处理下采收期烤烟RuBPCase的活性Fig. 2 RuBPCase activity of flue-cured tobacco during harvest under different treatments

2.6 不同处理对烟株硝酸还原酶活性的影响

从图3 可见，不同施肥处理采收期烤烟硝酸还原酶（NR）活性由大到小依次为T4＞T2＞T3＞T1，其中，T4 处理显著大于其他3 个处理，T1 处理显著小于其他3 个处理，T2 和T3 处理差异不显著。烟稻2 季均化肥和有机肥配施处理的烟株叶片NR 活性显著高于其他施肥处理，烟稻2 季仅施用化肥处理的烟株叶片NR 活性显著低于其他处理，表明配施有机肥提高了烟株NR 活性，促进了烟株后期氮代谢过程。

2.7 不同处理对烟株谷氨酰胺合成酶活性的影响

从图4 可见，不同处理采收期烤烟谷氨酰胺合成酶（GS）活性由大到小依次为T2＞T4＞T3＞T1，T2 处理GS 活性显著高于其他3 个处理，T1、T3、T4 处理间差异不显著，说明配施一定量有机肥能提高烟株对氨的同化及氮素的利用。T4 处理GS 活性显著低于T2 处理，可能是由于T4 处理配施有机肥量较多，在一定程度上抑制了GS活性。

图4 不同处理下采收期烤烟GS活性Fig. 4 GS activity of flue-cured tobacco during harvest under different treatments

2.8 不同处理对烟株蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶活性的影响

从图5 可以看出，不同处理采收期烤烟蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性由大到小依次为T4＞T2＞T3＞T1，T4处理SPS活性显著高于其他3个处理，T1处理SPS活性显著低于其他3个处理，T2、T3处理间差异不显著。蔗糖合成酶（SS）活性由大到小依次为T2＞T4＞T3＞T1，T2、T4 处理间差异不显著，但都显著高于T1、T3处理，且T3处理SS活性显著高于T1 处理。说明配施有机肥能显著提高烤烟叶片光合产物转化为蔗糖的能力，且仅烤烟季配施比仅水稻季配施提高效果更明显，烟稻2 季均化肥和有机肥配施提高效果最好。

图5 不同处理下烟株SPS和SS活性Fig. 5 Activities of SPS and SS in tobacco plant under different treatments

3 讨论

有机肥有助于改善烟叶外观质量、协调烟叶化学成分[17]。本研究表明，有机肥配施能够提高烟叶叶绿体色素含量，提高光合电子传递，促进光合作用，提高碳氮代谢关键酶活力。T2和T3处理在1 年中有机肥施用量相同，但类胡萝卜素含量却为T2＞T3，说明有机肥肥效主要在当季释放。当烤烟季施肥相同时，叶绿体色素含量却为T3＞T1、T4＞T2，这主要是由于T3、T4 处理水稻季施用了有机肥，有机肥肥效的释放过程缓慢，除了被水稻利用外，肥效可持续到烤烟季。本研究中，配施有机肥处理的烟株总叶绿素含量均高于仅化肥施用的烟株，这与宋玉川等[18]研究结果一致。所有处理的Fv/Fm均在0.53～0.85 之间，说明试验烟株PSⅡ功能完整，但T4处理的最大荧光（Fm）和可变荧光（Fv）均最大，说明T4 处理烟株PSⅡ活性最高，且T4 处理Fv/Fo最大，反映了PSⅡ对激发能量的使用效率最高，能量耗散少。此结果与T4处理的净光合速率（Pn）最大一致。本研究中T4 处理的净光合速率（Pn）最大，而净光合速率（Pn）高的处理气孔导度（Gs）高，胞间CO2浓度(Ci)却低；说明不同施肥处理的光合作用受到非气孔因素的影响，可能是由于叶绿素含量的差异和光合电子传递效率的差异共同导致的。常浩杰等[19]在番茄幼苗中的研究也表明增施不同生物有机肥对光合速率均有促进作用。曾祥难等[20]研究表明，合理配施复合有机肥在一定程度上有利于促进烤烟生长的光合速率，并在生长后期仍能保持一定的生理代谢强度，持续地促进光合产物合成。

与烟稻季均仅施用化肥相比，配施有机肥提高了烟叶RUBPCase、NR、GS、SPS 和SS 活性。本研究结果显示，烟稻2 季均施用有机肥处理的烟株RUBPCase 活性高于其他处理，促进其碳的同化代谢过程，与杨凯等[21]研究结果相同。烟稻季都施用有机肥的烟株SPS活性显著高于其他施肥处理，促进光合作用产物向蔗糖的转化。张玉平等[22]研究结果也同样显示，有机无机肥配施有利于改善春玉米光合特性，提高玉米功能叶蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性。配施有机肥处理，烟株SS活性显著高于纯化肥处理，表明有机肥的施用促进了蔗糖的分解，提高了烟株内碳代谢水平。本研究结果显示，烟稻2 季均配施有机肥能显著提高烟株的NR 活性，这可能是由于有机肥的配施除提供碳源外，还在一定程度上增加氮源，在提高烟株碳代谢过程中协同促进烟株氮代谢过程。宋玉川等[18]研究结果表明，配施有机肥的处理烟叶NR活性高于单施无机肥的烟叶，与本研究结果相同。T2 处理GS 活性显著高于其他3 个处理，且T1、T3、T4 处理间差异不显著，这可能是由于T4处理有机肥的施用量过多，在一定程度上抑制了GS 活性。杨凯等[21]研究表明熏蒸和有机替代均提高了西瓜果实氮代谢关键酶（NR、NiR、GS、GOGAT）的活性，与本研究结果相似。

目前烤烟生产中较为重视烤烟季有机肥的施用，从本研究结果看，水稻季施用饼肥对烤烟生长仍有较明显的影响。因此，土壤质量的提升和烤烟生产的可持续发展是个综合过程，应综合考虑烤烟和水稻2 季的施肥措施改进。与烟稻季仅施用化肥相比，有机肥的配施提高了烟株叶绿体色素含量、光合电子传递效率进而促进烟叶光合作用，协调了碳氮代谢过程，以烟稻2 季均化肥有机肥配施处理的提高作用最明显。总体来看，仅1季化肥有机肥配施时，施用在烤烟季的促进效果更好。与其他处理相比，烟稻2 季均化肥有机肥配施更能满足烟株对养分的需求，不仅能显著的提高光合作用，更能够促进光合产物的转化以及氮代谢水平，从而保证了烟株体内各种代谢过程的顺利进行，有利于烟叶在田间养熟和优质烟叶的品质形成。