环状RNA UBAP2在结直肠癌患者中的表达及与预后的关系

刘佳贞,焦 瑞

1.杨凌示范区医院肛肠外科,陕西咸阳 712199;2.西北大学附属神木医院消化内科,陕西榆林 719300

结直肠癌是由于多种基因或体细胞发生突变造成多条信号通路失调,导致肿瘤发生、发展和侵袭的异质性疾病,其在全世界范围内发病率和病死率居高不下,且发病率呈增加的趋势[1]。多数结直肠癌患者就诊时已处于中晚期,5年生存率低。因此,找到一种行之有效的方法快速准确地进行疾病诊断和及时干预,对结直肠癌的临床治疗具有重要意义。环状RNA是一种3′和5′末端以磷酸二酯键共价结合形成的环状RNA分子,具有序列高度保守、环状结构稳定、不易分解等特性,在哺乳动物细胞中广泛表达。环状RNA在转录后调控中发挥重要作用,通过多种途径调控下游基因的转录和表达,与动脉粥样硬化、肺纤维化、肿瘤、心力衰竭、阿尔茨海默病、心肌损伤等多种疾病有关,同时在不同的癌症亚型中具有各自独特的表达谱[2]。研究表明,环状RNA泛素关联蛋白2(UBAP2)是参与卵巢癌、神经胶质瘤、胰腺癌、食管癌等多种癌症进展的关键调节因子,在癌细胞的恶性生物学行为中起着重要作用[3]。然而,目前环状RNA UBAP2在结直肠癌中的作用仍未明晰。因此,本研究通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测环状RNA UBAP2在结直肠癌患者血清和癌组织中的表达水平,分析其与患者临床病理特征和预后的关系,为结直肠癌的有效诊治和预后提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2019年6月于杨凌示范区医院住院进行手术的80例结直肠癌患者为研究对象。纳入标准:(1)所有患者符合结直肠癌诊断标准[4];(2)术中成功获取组织标本并保存完整,患者随访资料齐全;(3)患者入院前未进行过放疗、化疗或手术等治疗。排除标准:(1)有结直肠癌手术史者;(2)其他部位恶性肿瘤者;(3)自身免疫性疾病者;(4)全身感染性疾病者;(5)临床资料不完整者。另选取一般资料与结直肠癌患者匹配的80例同期门诊健康体检者为对照组。本研究遵循世界医学协会赫尔辛基宣言,研究对象本人详知此项研究内容,并自愿签署同意书。

1.2方法

1.2.1标本收集 结直肠癌患者术前、健康对照者体检当日采静脉血3～5 mL于干燥试管中,以1 643.46×g的相对离心力进行离心,分离血清后分装于无菌EP管中,于-20 ℃冰箱中保存待检。结直肠癌患者术中切除的结直肠癌组织和癌旁组织置于冻存管中并投入液氮中保存,之后迅速转移至-80 ℃冰箱保存待测。

1.2.2qRT-PCR检测环状RNA UBAP2表达水平 采用RNA提取试剂盒(上海生工生物有限公司)提取血清样品总RNA,使用Trizol试剂(上海文韧生物科技有限公司)分离提取结直肠癌组织和癌旁组织总RNA。按反转录试剂盒(德国Qiagen公司)操作步骤反转录合成cDNA。qRT-PCR检测环状RNA UBAP2的表达水平。根据ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书设计反应体系,反应程序:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性10 s、60 ℃退火1 min、72 ℃延伸30 s,40个循环。在ABI(Applied Biosystems)7500 Fast系统上进行qRT-PCR反应。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参,根据公式2-ΔΔCt计算环状RNA UBAP2基因的表达水平。基因引物经设计软件设计后由上海生工生物工程有限公司合成,序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3结直肠癌患者临床病理资料收集 收集结直肠癌患者性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤部位、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度等基本资料。

1.2.4随访 主要以电话及门诊复查的方式对所有结直肠癌患者进行为期3年的随访,患者出现复发或死亡时则随访结束,患者随访率为100%,随访截至2022年6月。

2 结 果

2.1外周血标本中环状RNA UBAP2的表达分析 结直肠癌患者外周血中环状RNA UBAP2的表达水平为2.06±0.97,高于健康对照者的1.02±0.14,差异有统计学意义(t=9.491,P<0.001)。

2.2组织标本中环状RNA UBAP2的表达分析 结直肠癌组织中环状RNA UBAP2的表达水平为3.84±1.21,高于癌旁组织的1.05±0.16,差异有统计学意义(t=20.466,P<0.001)。

2.3结直肠癌组织环状RNA UBAP2表达水平与患者临床病理特征的关系 以结直肠癌组织环状RNA UBAP2表达水平均值3.84为界限,≥3.84视为高表达,<3.84视为低表达,将结直肠癌患者分为环状RNA UBAP2高表达56例,环状RNA UBAP2低表达24例。结果显示,结直肠癌组织环状RNA UBAP2的表达水平与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度有关(P<0.05),与患者年龄、性别、肿瘤最大径、肿瘤部位无关(P>0.05)。见表2。

表2 结直肠癌组织环状RNA UBAP2表达水平与患者临床病理特征的关系[n(%)]

2.4结直肠癌组织环状RNA UBAP2表达与患者预后的关系 直肠癌组织中环状RNA UBAP2高表达患者3年生存率(39/56,69.64%)低于RNA UBAP2低表达患者(21/24,87.50%),差异有统计学意义(Log-Rankχ2=4.207,P<0.05)。见图1。

图1 结直肠癌组织环状RNA UBAP2表达与患者3年 生存率的关系

2.5多因素COX回归分析结直肠癌患者预后的影响因素 以结直肠癌患者3年内是否死亡为因变量(生存=0,死亡=1),以环状RNA UBAP2表达水平(高表达=1,低表达=0)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期=0,Ⅲ+Ⅳ期=1)、淋巴结转移(有=1,无=0)、浸润深度(深层=1,浅层=0)、分化程度(低分化=1,中/高分化=0)为自变量,以生存时间为时间变量,进行多因素COX回归分析,结果显示环状RNA UBAP2、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度是结直肠癌患者预后的影响因素(P<0.05)。见表3。

表3 多因素COX回归分析结直肠癌患者预后的影响因素

3 讨 论

结直肠癌的发生与遗传、久坐不动、烟草、酒精的滥用等不良生活习惯有关,然而结直肠癌早期没有明显症状、不易察觉,随着病情发展,常表现为便血、缺铁性贫血、腹痛、肠梗阻、体质量减轻、食欲减退等,是一种复杂的多因素疾病[5]。结直肠癌可通过淋巴结、血液及腹膜发生转移,大约20%的结直肠癌患者在诊断时已发生转移,而发生转移的结直肠癌更难治愈。快速准确的疾病诊断、及时的医疗干预可以帮助临床医生确诊疾病并做出必要的治疗决定,帮助患者康复。因此,迫切需要寻找有效的、与临床相关的早期诊断标志物,这对提高结直肠癌的治疗效果和改善患者预后具有重要意义。

环状RNA是mRNA异常剪切的产物,对核酸酶不敏感,且比普通线性RNA更稳定,其不编码蛋白质,但能够调节基因表达,在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程发挥重要的作用[6]。研究表明环状RNA利用其环化作用竞争性抑制miRNAs的线性剪接和海绵功能,调节相应下游基因的表达,从而促进癌症的发展[7]。环状RNA UBAP2是一种新发现的环状RNA,作为致癌基因也是多种肿瘤发生、发展的重要调控因子[8]。血清学指标在结直肠癌患者的病情监测方面起着重要的作用,其检测方便、快速,且短期内可反复测量。本研究发现,结直肠癌患者血清中环状RNA UBAP2的表达水平显著高于健康对照者,提示环状RNA UBAP2可能参与结直肠癌的发生过程,可作为结直肠癌早期诊断的潜在标志物。

XU等[9]发现环状RNA UBAP2在卵巢癌组织和细胞系中表达上调,通过和下游miRNA结合,促进卵巢癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。本研究发现结直肠癌组织中环状RNA UBAP2表达水平显著高于癌旁组织,提示环状RNA UBAP2可能与结直肠癌的恶性程度有关,在结直肠癌的发展过程中,发挥促癌基因作用。WANG等[10]发现环状RNA UBAP2在三阴性乳腺癌中高表达,且环状RNA UBAP2高表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征及患者的预后不良有关。本研究将结直肠癌组织中环状RNA UBAP2表达水平与患者临床病理特征结合进行分析,发现环状RNA UBAP2的表达水平与TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度有关,推测环状RNA UBAP2可能是通过影响结直肠癌微环境中来参与其进展。研究进一步分析了80例结直肠癌患者3年随访资料,结果显示环状RNA UBAP2低表达的患者3年生存率较高。本研究同时进行了多因素COX回归分析,结果显示,环状RNA UBAP2、TNM分期、淋巴结转移、浸润深度、分化程度是影响结直肠癌患者预后的因素。以上结果均提示环状RNA UBAP2高表达预示着预后不良,可能作为促癌因子在结直肠癌的发生、发展中起作用。

综上所述,结直肠癌患者血清和癌组织中环状RNA UBAP2表达水平显著升高,RNA UBAP2是影响结直肠癌患者预后的敏感指标。然而环状RNA UBAP2参与结直肠癌发生、发展的具体机制仍需进一步探究。