抗鼠棒状杆菌单克隆抗体制备及鉴定

余建国 朱楼英

(1.金华职业技术学院 浙江金华 321017；2.金华市实验动物中心 浙江金华 321007）

鼠棒状杆菌 （Corynebacterium kutscheri，CK）主要寄生于大鼠、小鼠上呼吸道，为动物源性致病菌，常为隐性感染。 临床上主要表现伪结核症状或化脓性炎症， 在鼠免疫功能损伤或抑制、 外界环境改变时，可引起鼠急性死亡。

实验动物国家检测标准中， 鼠棒状杆菌是清洁级大鼠、小鼠必须排除的项目。鼠棒状杆菌调查诊断方法目前有病原菌分离培养方法、免疫学方法、分子生物学（PCR）方法。实验动物国家标准（GB/T14922-2011）中规定的检测方法也是细菌学分离、血清学检测，该检测方法操作复杂，耗时长，容易造成漏检。PCR 法虽然灵敏、快速，但仪器设备要求高，检测成本昂贵，不适合基层规模推广应用。

单克隆抗体技术的发展及其优越性，在农业、医学等生物技术领域得到了广泛应用。 在鉴定细菌种类方面， 单克隆抗体技术具有的高灵敏性和高特异性是其它方法无法比拟的。 本研究通过细胞融合技术，筛选出分泌抗CK 单抗的杂交瘤细胞株，从而制备灵敏且特异度高的单克隆抗体， 为构建可用于临床快速检测的血清学方法奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 BALB/c 雌性小鼠(6～8 周龄)，由金华市实验动物中心提供； 鼠棒状杆菌的纯培养菌体，由浙江省实验动物中心惠赠。

1.1.2 试剂 鼠棒状杆菌ELISA 检测试剂盒、牛血清白蛋白、卵清蛋白等，市售；PBS、CBS 等缓冲液由实验室自制。

1.2 方法

1.2.1 免疫抗原制备 收集鼠棒状杆菌的纯培养菌体，以小体积生理盐水调至悬浮，冰浴条件下超声粉碎5 min (150 W)， 粉碎物4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，收集上清。细菌沉渣重复超声5 min，重复离心，取上清液4 ℃冷藏备用。

1.2.2 动物免疫 取4 只BALB/c 雌性小鼠（6～8 周龄）， 颈部及背部皮下多点注射免疫， 免疫剂量为50 μg/只，共免疫4 次。 初次免疫为1.2.1 中制备的免疫原与等体积弗氏完全佐剂乳化；加强免疫时，免疫抗原与等体积弗氏不完全佐剂乳化， 免疫剂量方式等均不变。 免疫间隔期为21 d， 第4 次免疫后10 d， 采尾根血10 μL， 加入到990 μL PBS 中，混匀，5 000 r/min 离心10 min，弃沉淀；收集上清、混匀，5 000 r/min 离心10 min， 弃沉淀， 上清保存在-20 ℃冰箱中备用。

1.2.3 细胞克隆 将致敏的脾细胞与SP2/0 瘤细胞以按文献方法进行融合[1]。 14 d 后，用含鼠棒状杆菌的大鼠肝匀浆做抗原，检测培养上清。 融合前1 周，采用常规方法处理，复苏冻存的SP2/0 细胞；采集血清效价符合试验要求的小鼠脾细胞， 转移至无菌筛网上，以注射器硅胶头充分研磨脾脏，重复滴加PBS冲洗筛网3 次，收集研磨混合液，转移至无菌离心管中，1 000 r/min 离心5 min， 收集后重悬15 min，以PBS 液洗涤溶液3 次，计数。

将SP2/0 细胞与脾脏细胞按1:5 混合， 按文献方法进行细胞融合[2]。 采用间接ELISA 方法进行克隆筛选， 获得能分泌抗鼠棒状杆菌的特异性抗体且稳定生长的瘤细胞系。 收集单克隆抗体细胞培养上清，用于鉴定，将细胞冻于-80 ℃保存备用。

1.2.4 单克隆抗体的制备与纯化

1.2.4.1 单抗的制备 采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体，选取10 周龄左右的F1 昆明小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL 液体石蜡，5 d 后通过腹腔注射处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞， 每只小鼠注射1×106个细胞；7～10 d 后， 待小鼠腹部明显膨大时，无菌收集小鼠腹水，以3 000 r/min 离心15 min，以去除细胞与杂质，加入适量防腐剂（防腐剂体积为腹水体积的0.05%），收集腹水上清并于-80 ℃冻存备用。

1.2.4.2 单抗的纯化 以辛酸硫酸铵沉淀法对单克隆抗体纯化[3]。 将醋酸钠-醋酸缓冲液（0.05 mol/L，pH4.2）与小鼠腹水上清按1:2 混合均匀，室温下均匀加入正辛酸（每毫升上清加25 uL）；4 ℃静置2 h，低温下以15 000 r/min 离心30 min， 收集滤纸过滤液，校正pH 值至7.2。 冰浴条件下，均匀缓慢加入饱和硫酸铵溶液，调整硫酸铵的饱和度至45%，继续搅拌30 min， 冰上静置4 h，4 ℃下10 000 r/min 离心30 min，弃掉上清，保留沉淀；向沉淀中加入2 mL PBS，将溶液混匀后转移至PBS 缓冲液中进行透析；透析液体在4 ℃条件下12 000 r/min 离心25 min，收集上清并分析抗体纯度。

1.2.5 单克隆抗体的鉴定

1.2.5.1 单抗效价和灵敏度测定 用1.2.2 中制取的血清，采用间接ELISA 法测定杂交瘤细胞培养上清诱导小鼠产生的腹水效价， 抗体浓度稀释倍数依次为2×102、4×102、8×102、16×102、32×102、64×102、128×102， 配置浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 ng/mL（CK 菌液悬液），用作灵敏度检测。

1.2.5.2 抗体特异性的鉴定 以间接竞争ELISA法，设定泰泽氏菌（BP）、巴氏杆菌（PMU）、沙门氏菌（SE）、弓形虫（TO）为参照，检测单抗与CK 类似物的交叉反应。

1.2.5.3 亲和力试验 亲和力反应可以提示单抗（mAb）的纯度，本试验采用间接ELISA 法检测mAb与5 种免疫球蛋白的交叉反应。 取1 μg/mL 天然IgE、IgG、IgM、IgA、IgD，按0.1 mL/孔进行包被，一抗选用非血清培养细胞上清液（0.1 mL/孔），二抗选取临时稀释的HRP 标记的山羊抗小鼠IgG （0.1 mL/孔）。 各孔加入0.1 mL TMB 进行显色，最后各反应孔中加入2 mol/L 硫酸0.05 mL 终止反应。 于450 nm 处测各孔吸光度（A）值（见图1）。

结果显示：4 只实验鼠的免疫抗体都能被CK 抗原抑制，半数抑制浓度（IC50）在150～4.69 ng/mL，其中3 号小鼠的IC50最好，由抑制曲线（见图2）计算IC50为4.77 ng/mL。 3 号鼠的血清效价最高，灵敏度最强，所以，3 号鼠备选作亲和试验。 据CK-mAb 灵敏度测定结果， 可得亲和度线性回归方程：y=-0.4229x+0.4714，R2=0.0782， 经计算， 其IC50为0.86 ng/mL[10]。 亲和曲线显示（见图2）：当包被抗原浓度为1.0 μg/mL 和0.5 μg/mL，mAb 与抗原结合达到50%饱和状态时的浓度分别为3.16 μg/mL 和2.85 μg/mL，通过亲和常数公式计算出亲和常数Ka为1.96×109L/mol[4]。

图2 3 号鼠亲和力检测结果

2 结 果

2.1 单抗效价和灵敏度检测结果 由表1 可知，第4 次免疫10 d 后，4 只受免鼠均产生了血清学抗体，效价在1.6×103～1.28×104，抗体水平均值非常高。 免疫小鼠血清单抗灵敏度检测结果见表2。

表1 单抗效价检测结果

表2 单抗灵敏度检测结果

2.2 单抗（CK-mAb）特异性鉴定 3 号小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0 融合后，经过有限稀释法[5]亚克隆和ELISA 筛选， 最后得到1 株能够稳定分泌抗CK-mAb 的杂交瘤细胞09A2B5，通过体内诱生腹水法批量制备出抗体。 间接ELISA 测定腹水效价，细胞上清的效价为1:1 600，腹水的效价为1.256×105。从特异性试验结果间接可知（见表3），单抗与泰泽氏菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、弓形虫的交叉反应比例分别为1.47%、0.91%、0.42%、0.06%。

表3 特异性试验结果

3 讨论与分析

单克隆抗体制备中， 高效价抗体的获取相对简易，但抗体的特异性易因杂蛋白干扰而呈现异常[6]。本试验制备的鼠棒状杆菌单克隆抗体 （CK-mAb），具有良好的特异性，为构建血清学快速检测方法（胶体金检测法）奠定了坚实的基础。

本研究在筛选瘤细胞系过程中， 采用了有限稀释法，该法的缺点是需要进行多次克隆，延展了试验周期。有文献提示，甲基纤维素半固体培养基法可以较好解决这一问题[7]，在未来的研究中有待进一步探索。

在mAb 交叉免疫试验中，mAb 与天然IgE 的反应性总体较好，与其它免疫球蛋白的反应性极低，提示单抗本身极强的亲和性。文献提示，单抗的亲和力与蛋白表达系统有密切关联， 利用哺乳动物蛋白表达系统， 活性蛋白所必需的空间结构和修饰更接近于天然状态，与原核表达系统比较，能弥补缺少高级修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，表达的蛋白不能很好地折叠等缺陷， 对单克隆抗体的表达具有明显的优势。

实验动物的快速检测技术相对缺乏， 以小鼠棒状杆菌单克隆抗体为基础的快速检测方法的构建，为实验动物微生物评价和质量控制提供了一条新的途径。尤其是在病毒测定中，快速检测可以发挥积极的作用。