枇杷叶提取物干预博莱霉素诱导肺纤维化大鼠MH-S细胞炎症反应及机制研究

王俊男，杨亚萍※，张靖

（1.张家口市第一医院呼吸内科，河北 张家口 075000；2.张家口市第一医院神经内科，河北 张家口 075000）

肺纤维化是多种弥漫性间质肺疾病的主要结局，具有进行性、间质纤维化等特点，其中特发性肺纤维化（PF）最为常见。研究发现，PF预后效果差，发病率和死亡率逐年上升[1,2]。临床主要表现为肺纤维化严重，肺泡巨噬细胞炎症因子堆积、成纤维细胞募集和大量细胞外基质（ECM）沉积等[3-7]。研究表明，枇杷叶提取物为蔷薇科植物枇杷[Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.]的干燥叶，采用水蒸气蒸馏法提取后的活性成分，主要含有三萜酸、挥发油、倍半萜、黄酮和糖苷类等成分，而三萜酸类成分为其主要的活性成分，具有拮抗肺纤维化损伤的作用，但其机制尚不清楚[8]。本研究从枇杷叶提取物与肺泡巨噬细胞炎性因子临床相关性着手，旨在探究枇杷叶提取物在肺纤维化过程中肺泡巨噬细胞相关炎症因子NF-κB、IL-17、TNF-α和MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白p-p38 p-ERK1/2 等的表达情况，以期为肺纤维化提供新的治疗途径。

1 材料与方法

1.1 试验动物

Wistar 大鼠，雄性，SPF 级，7 周龄，180～240 g，购自深圳海思安生物技术有限公司，许可证号为SCXK（深）2019-0006，全部试验大鼠置于无菌动物饲养室（温度：20～24 ℃，湿度：65%～75%），光照12h/黑暗12h内适应性饲养1 周。

1.2 试验材料

博莱霉素（CAS：11006-33-0，货号：YT2280，规格：8×1.25 mL），购自哈尔滨博莱制药有限公司；甲泼尼松龙片（批准文号：H31020771），购自上海上药信谊药厂；NF-κB、IL-17 和TNF-α ELISA 试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自上海富雨生物试剂有限公司；枇杷叶固形物（来自中国科学院植物研究所，CAS：0725-008，主要成分为三萜酸类，HPLC 检测含量约1.32%）；甲泼尼龙琥珀酸钠注射液（批准文号：H20080284），购自辉瑞制药有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 药物制备 用天平称取枇杷叶固形物50 g，粉碎，过40 目筛，置于烧杯中，加入100mL蒸馏水，4 ℃，浸泡3 h，用水蒸气蒸馏法提取制备标准浓缩液，以0.9%氯化钠溶液混匀后制备1.27、2.54、3.81 mL/kg的混悬液，备用。

1.3.2 肺纤维化Wistar 大鼠模型制备及样本采集将120 只雄性Wistar 大鼠随机分为生理盐水（NS）组、模型（BLM）组、阳性对照组（0.45 mg/kg）、EBJE高（3.81 mL/kg）、中（2.54 mL/kg）、低（1.27 mL/kg）剂量组，每组20 只。各组气管内一次性灌注博来霉素（5 mg/kg），生理盐水（NS）组给予同等体积的生理盐水灌注，制备肺纤维化模型。造模成功后第1 天开始灌胃给药，1 次/d，共28 d。依据《药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算》[9]，NS组、模型组给予1 mL 生理盐水溶液，高、中、低剂量组分别给予1 mL枇杷叶混悬液，浓度分别为3.81 mL/kg、2.54 mL/kg、1.27 mL/kg，阳性对照组给予1 mL，0.45 mg/kg甲泼尼龙琥珀酸钠注射液。造模后第29 天腹腔注射20%乌拉坦麻醉处死，取双侧肺组织，左肺去除筋膜、肌肉和结缔组织，3 000 r/min，离心20 min，吸取上清液，经流式细胞仪分离MH-S 细胞，右肺多聚甲醛固定，进行病理染色。

1.3.3 Masson染色 右肺4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，厚度4μm，完全脱蜡脱水后2 h 内进行Masson 染色，分别给予2.5% 浓度的重铬酸钾、1.37% 浓度铁苏木素、3.0% 丽春红酸性品红染色，经醋酸－磷钼酸处理后行苯胺蓝染色，分化，中性树胶封片。显微镜观察肺炎症浸润和肺纤维化程度。

1.3.4 RT-PCR 测定大鼠MH-S 细胞NF-κB、IL-17 和TNF-α mRNA 表达量 以GAPDH 为内参，NCBI 选取Wistar 大鼠中基因序列，cDNA 文库法设计NF-κB、I L-17、TNF-α的PCR 引物，NF-κB、IL-17、TNF-αq PCR试剂盒，扩增参数：首次温度95 ℃，4 min；二次淬火93 ℃，8s；扩增参数：55 ℃，45 s，30 个循环。2-∆∆Ct法衡量NF-κB、IL-17 和TNF-α mRNA 的相对表达量。

1.3.5 ELISA 检测大鼠MH-S 细胞NF-κB、IL-17 和TNF-α蛋白表达量 收集MH-S细胞上清液，3000r/min，离心20 min；取上清液于1.5 mL EP管内保存。NF-κB、IL-17 和TNF-α蛋白表达量、依据ELISA 试剂盒说明书严格操作，A450 nm测定OD 值，计算大鼠NF-κB、IL-17 和TNF-α/MAPK 水平，重复3 次。依据ELISA集成试剂盒标注的标准蛋白浓度曲线计算浓度。

1.3.6 Western Blot检测大鼠MH-S细胞p-p38 MAPK，p-38 MAPK，p-ERK1/2，ERK1/2 蛋白表达量 收集MH-S 细胞上清液，依据试剂盒说明书提取蛋白质，12 000 r/min，20 min 离心，制备蛋白样品，备用。制备10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶作为分离胶，制备4% SDS-聚丙烯酰胺凝胶作为浓缩胶，进行Western Blot 试验，检测MH-S细胞p-p38 MAPK，p-38 MAPK，p-ERK1/2，ERK1/2 蛋白表达量。

1.4 统计学分析

2 试验结果

2.1 各组大鼠肺纤维化病理变化情况

显微镜观察显示，NS 组肺组织基本正常，模型组肺组织出现明显的纹理增粗，肺空洞比例增加，肺组织炎症因子浸润等现象，肺纤维化进程明显，提示造模成功；与模型组相比，枇杷叶提取物高、中、低剂量组肺组织纹理增粗现象明显得到改善，肺空洞比例明显降低，高剂量组变化最为明显，提示不同浓度枇杷叶提取物可以起到干预肺组织炎症因子浸润和肺纤维化进程的作用（如图1）。

图1 各组肺纤维组织Masson 病理染色（100 ）Fig.1 Masson pathological staining of lung fibrous tissue in each group(100)

2.2 各组大鼠MH-S细胞NF-κB、IL-17和TNF-α炎性因子mRNA表达情况

与NS 组相比，模型组NF-κB、IL-17 和TNF-α的mRNA 水平明显升高（P ＜0.05）；模型组相比，阳性对照组，枇杷叶提取物各剂量组NF-κB、IL-17 和TNF-α的mRNA 水平显著下降（P ＜0.05）且NF-κB、IL-17和TNF-α mRNA 相对表达量与干预浓度呈负相关（r=-0.754、-0.826、-0.810，Z=19.254、29.551、24.777），见表1。

表1 各组NF-κB、IL-17 和TNF-α炎性因子mRNA 相对表达水平Table 1 Relative mRNA expression levels of NF-κB,IL-17 and TNF-α inflammatory factors in each group

2.3 各组大鼠MH-S细胞NF-κB、IL-17和TNF-α炎性因子蛋白表达情况

与NS 组相比，模型组肺组织大鼠MH-S 细胞NF-κB、IL-17 和TNF-α的浓度明显升高（P ＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组，枇杷叶提取物各剂量组NF-κB、IL-17 和TNF-α的蛋白表达水平明显下降（P＜0.05）且肺组织MH-S 细胞NF-κB、IL-17 和TNF-α蛋白表达水平与干预浓度呈负相关（r=0.725、0.773、0.789，Z=17.256、11.254、25.364），见图2。

图2 各组NF-κB、IL-17 和TNF-α炎性因子蛋白表达水平Fig.2 Expression levels of NF-κB,IL-17 and TNF-α inflammatory factor proteins in each group

2.4 EBJE对各组MAPK表达水平的影响

与对照组相比，模型组中肺组织肺泡巨噬细胞MAPK 浓度明显降低（P ＜0.05）；与模型组相比，枇杷叶干预组、甲泼尼龙琥珀酸组MAPK 的表达水平明显上升（P ＜0.05）；枇杷叶各剂量组比较中，肺组织肺泡巨噬细胞MAPK 与干预浓度呈正相关（r=0.826,Z=35.007），见表2。

表2 EBJE 干预后各组MAPK 表达水平Table 2 MAPK expression levels in each group after EBJE intervention

2.5 肺巨噬细胞MAPK蛋白表达水平与剂量相关性

剂量相关性比较中，肺巨噬细胞MAPK 蛋白表达水平与枇杷叶提取物浓度呈正相关，且总体相关度为0.895（Z=11.254），见表3。

表3 肺巨噬细胞MAPK 蛋白表达水平与剂量相关性Table 3 Dose dependence of MAPK protein expression levels in lung macrophages

2.6 各组大鼠MH-S细胞p-p38 MAPK，p-38 MAPK，p-ERK1/2，ERK1/2蛋白表达情况

与NS 组比较，模型组MH-S 细胞p38 MAPK 的磷酸化水平和ERK1/2 的磷酸化水平明显升高（P ＜0.05），与模型组相比，阳性对照组，枇杷叶提取物各剂量组p38 MAPK 的磷酸化水平和ERK1/2 的磷酸化水平明显降低（P ＜0.05）且与干预浓度呈负相关。

3 讨论

肺纤维化在临床上一般具有诱因多样、病情进展复杂，抗纤维化药物应用疗效欠佳等临床特点[10]，吡非尼酮（Pirfenidone,PFD）和尼达尼布（Nintedanib,BIBF 1120）的出现和临床应用，虽然在一定程度上增加了肺纤维化患者的治疗选择性，并且有一定临床效果[11]，但是具有费用昂贵、患者依从性差、预后效果不明显和临床副作用大等缺点，限制了患者的使用，中医药治疗相对于西医治疗，具有作用机制途径多、靶点富集、副作用较少等明显的优点，多种代表性的中医药产物，如黄芪甲苷在治疗肺纤维化方面取得了很大的进展[12,13]。因此，针对肺纤维化的中医药研究成为新的治疗靶点。

研究表明，NF-κB、IL-17 和TNF-α是衡量肺纤维化常用的标志之一，能有效反应肺纤维化进展[14]，NFB是细胞内重要的核转录因子，参与了多种细胞因子及炎症介质的转录调控，阻断NF-κB 激活及炎症因子介导的炎症反应是肺纤维化防治的重要手段。丝裂酶原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPKs）级联反应信号通路与炎症氧化应激密切相关，抑制MAPK 信号通路能明显减轻肺纤维化。研究报道，枇杷叶提取物具有抗炎、抗氧化等作用，但关于枇杷叶提取物拮抗肺纤维化中MAPK 通路的机制尚未阐明[15]。本文通过将枇杷叶提取物应用到大鼠肺纤维化模型中，对NF-κB、IL-17 和TNF-α等炎症因子转录水平和蛋白水平进行检测，发现枇杷叶提取物对肺纤维化炎症损伤具有很好的治疗作用，且高剂量具有更好地效果，同时，通过对MAKP/NF-κB 信号通路相关蛋白磷酸化程度进行检测，发现枇杷叶提取物可以通过干预MAKP/NF-κB 信号通路达到减缓肺纤维化程度和炎症浸润程度的作用。本研究为枇杷叶的新型中药制剂及保健食品的开发提供了研究基础，有利于后期进一步的开发研究。