传染性脾肾坏死病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

李望东，李 勇，张淑瓶，盘润洪，蓝间媛，曾俊霞，侯月娥

（1.珠海市现代农业发展中心，广东珠海 519070；2.珠海科艺普检测科技有限公司，广东珠海 519070）

传染性脾肾坏死病毒（infection spleen and kidney necrosis virus，ISKNV），属于虹彩病毒科巨大细胞病毒属成员，可感染鳜鱼（Siniperca chuatsi）、大口黑鲈（Micropterussalmoides）花鲈（Lateolabraxjaponicas）、乌鳢（Ophiocephalus argus）等50多种经济鱼类[1]。1994年ISKNV感染疫情在我国广东省首次暴发，随后迅速蔓延到其他省份[2]。吴淑勤等[2]在鳜鱼体内检测到一种粒径为150 nm的球状病毒，认为可能是鳜鱼暴发性感染的主要病原体。因为这种病毒主要在鳜鱼的脾脏和肾脏中传播，所以何健国等[3-4]把该病命名为“传染性脾肾坏死病”（infection spleen and kidney necrosis，ISKN），并对该病毒进行了基因组完整序列分析。ISKNV易与细菌发生继发感染，如无法得到及时有效的诊断和治疗，就会造成巨大经济损失[5-7]。目前，ISKNV的检测方法有很多种，包括病毒分离、电镜观察、普通PCR[8-9]。但这些方法均存在耗时长、操作复杂等弊端，不利于ISKNV的调查研究。因此，利用先进高效的分子生物学方法是目前诊断ISKNV感染最快速有效的手段。但是目前ISKNV的TaqMan荧光定量检测方法未形成统一标准，部分方法存在检测操作繁琐、耗时长，以及特异性、敏感性较差等问题，只能作为初步诊断方法[10]。TaqMan荧光定量方法相比较于其他分子生物学检测方法，具有高效、快速、精准的优点，并已在其他水生动物疾病诊断中得到成功应用，是未来水产行业病毒检测的发展趋势[11-12]。本研究旨在建立一种针对ISKNV的，具有特异性强、灵敏度高、精准的TaqMan荧光定量PCR方法，为快速、精准检测ISKNV提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株和检测样品 传染性造血器官坏死病毒（infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）、病毒性神经坏死病毒（viral nervous necrosis virus，VNNV）、大口黑鲈蛙虹彩病毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV）、黄颡鱼杯状病毒（Yellow catfish calicivirus，YCCV）、鳜鱼弹状病毒（Sinipercachuatsirhabdovirus，SCRV）灭活阳性样品以及233份临床样品，均由珠海科艺普检测科技有限公司保存，并经PCR扩增及测序。

1.1.2 主要试剂 病毒DNA/RNA小量提取试剂盒，广州吉瑞基因科技有限公司产品；2×Superstart Premix plus（Probe qPCR），珠海宝锐生物科技有限公司产品；Taq酶、pMDl8-T载体、DL 1000 DNA Marker，TaKaRa公司产品；质粒小量提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒，OMEGA公司产品；E.coli.DH5α感受态细胞，爱思进生物技术（杭州）有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 梯度PCR扩增仪（Thermal Cycler），型号S1000TM，Bio-Rad公司产品；荧光定量PCR仪，型号SLAN-96P，上海宏石医疗科技有限公司产品；电泳仪装置（PowerPacTMBasic），Bio-Rad公司产品；凝胶成像系统，型号65G-2000，珠海黑马医疗器械有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光PCR引物和TaqMan探针 根据GenBank中登录的ISKNV（AF371960.1）基因序列，利用Primer Premier 5和Oligo 7设计软件，依据TaqMan荧光定量PCR引物和探针的设计原理和要求，设计特异性引物和荧光探针（表1）。引物探针由昆山普诺普和生物技术有限公司合成。

表1 ISKNV TaqMan荧光定量PCR探针及扩增引物

1.2.2 样品前处理 取发病鱼组织（鳃、脾脏、肝脏、心脏、肠、脑）剪碎，混匀后取100 mg，放入带有钢珠的2 mL研磨管中，加入0.5～1.0 mL PBS，将研磨管置于研磨机中60 Hz、3 min，取出研磨管，用离心机5 000 r/min离心3 min，吸取上清液200 μL到离心管中备用。

1.2.3 ISKNV总核酸提取 按照病毒DNA/RNA小量提取试剂盒说明书操作，将提取的核酸以及阳性对照保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.4 标准品制备 取1.2.3中提取的总核酸，以ISKNV-qF/ISKNV-qR（10 pmol/L）为引物进行PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，取5 μL PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。将获得的ISKNV PCR产物琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化，分别克隆至pMD18-T载体中，转化到DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆重组质粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒命名为pMD-ISKNV。对阳性质粒进行浓度测定、拷贝数计算，然后分装，-80 ℃保存备用。

1.2.5 反应条件优化 ISKNV的引物和探针终浓度为0.1～0.6 mol/μL，退火温度为55～65 ℃，以不同浓度配比和不同退火温度进行荧光定量PCR反应，选择效果最佳的引物、探针浓度以及退火温度。

1.2.6 标准曲线建立 将制备好的ISKNV标准品进行10倍梯度稀释，用不同稀释梯度的核酸作为模板，每个梯度的核酸设立 3个重复；使用1.2.5筛选优化后的体系及条件进行TaqMan荧光定量PCR扩增。根据标准品拷贝数与Ct值建立标准曲线。

1.2.7 敏感性试验 将1.2.3提取到的总核酸进行浓度测定，并根据浓度进行10倍倍比稀释，共稀释5个浓度梯度（10-1～10-5），将其作为模板，参照水产行业标准《传染性脾肾坏死病毒检测方法》（SC/T 7211—2011）中的普通PCR方法和本研究建立的TaqMan荧光定量PCR分别进行扩增，比较两种方法的灵敏度。

1.2.8 特异性试验 使用本研究建立的方法，对IHNV、VNNV、LMBV、YCCV、SCRV进行 PCR扩增，验证本研究建立方法的特异性。

1.2.9 重复性试验 用建立的方法对已稀释的梯度质粒（1.0×101～1.0×105copies/μL）进行批内重复试验，间隔15 d分别进行3次批间重复试验，每个梯度浓度重复3次，对所得结果进行方差分析，计算批次内和批次间的变异系数。

1.2.10 临床样品检测 选取已知的ISKNV阳性样品76份、阴性样品157份，用本研究建立的ISKNVTaqMan荧光定量PCR进行检测。

2 结果与分析

2.1 标准品制备

重组质粒的PCR检测结果显示，ISKNV的扩增产物大小为87 bp，与预期大小一致；测序结果显示，ISKNV目的基因序列与GenBank公布的参考序列AF371960.1相似性达100%。结果表明，目的基因已被成功地插入载体上。

2.2 反应条件优化

对比不同的引物、探针浓度及退火温度，确定TaqMan荧光定量PCR反应体系：预混液12.5 μL，上游引物、下游引物各1.0 μL，探针0.5 μL，DNA模板2.0 μL，用水补足至25.0 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环，每个循环第二步收集荧光信号。

2.3 标准曲线建立

利用本研究建立的方法扩增了ISKNV不同浓度梯度（1×101～1×105copies/μL）稀释的标准品，结果如图1。该方法所构建的检测标准曲线具有等距性和平行性，并具有较好的梯度性，得到标准曲线方程为Ct = -3.537 5X+ 40.465，相关系数R2=0.997 2，扩增效率符合要求。

图1 ISKNV的 TaqMan荧光定量PCR标准曲线

2.4 敏感性试验

ISKNV的总核酸质量浓度为87 ng/μL。将ISKNV核酸样本10倍梯度稀释（8.7×101～8.7×10-4ng/μL），分别利用本研究建立的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR进行扩增。结果（图2～3）显示，TaqMan荧光定量PCR的最小检测量为8.7×10-4ng/μL，普通PCR为8.7×10-3ng/μL，TaqMan荧光定量PCR敏感性是普通PCR的10倍。结果表明，本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法敏感性较好。

图2 ISKNV TaqMan 荧光定量PCR敏感性试验结果

图3 ISKNV普通PCR敏感性试验结果

2.5 特异性试验

利用建立的TaqMan荧光定量 PCR方法，对常见鱼类病毒 IHNV、VNNV、YCCV和 SCRV的核酸反转录产物cDNA，LMBV、ISKNV的核酸DNA进行扩增。结果（图4）显示，TaqMan荧光定量PCR方法只检测出ISKNV核酸样本为阳性，其余5种鱼类病毒核酸样本均未出现扩增曲线。试验重复3次，均得到相同结果，表明建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异性良好。

图4 ISKNV TaqMan荧光定量PCR特异性试验结果

2.6 重复性试验

利用本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法，对不同浓度梯度的标准品进行批次内及批次间的重复性试验。结果（表2）显示，批次内及批次间的变异系数均小于2.0%。结果表明，本研究所建立的TaqMan荧光定量PCR方法的重复性和稳定性好。

表2 ISKNV TaqMan荧光定量PCR重复性试验结果

2.7 临床样品检测

应用建立的TaqMan荧光定量PCR方法，对已知结果的233份临床样品进行检测，检出76份阳性、157份阴性，与已知结果一致，表明该方法检测结果准确，可用于临床样本检测。

3 讨论

ISKN是一种高传染性、高致死性鱼类病毒性疫病，导致水产养殖业遭受巨大经济损失[13]。水产养殖过程中，针对ISKN的防控以预防为主，而病原检测是预防的关键步骤，对该病的快速、精准诊断极为重要。

本研究建立的TaqMan 荧光定量PCR选取了主衣壳蛋白（MCP）编码基因。该基因是虹彩病毒在晚期表达的基因，其编码的MCP是构成病毒二十面体衣壳的重要结构成分，参与ISKNV感染宿主细胞的过程[14]。比较氨基酸序列可知，同属虹彩病毒 MCP的氨基酸序列同源性大于90%，含有几个序列几乎完全一致的高度保守区，说明其氨基酸序列高度保守。而细胞肿大病毒属、蛙病毒属等这些不同属的虹彩病毒之间的MCP氨基酸序列同源性为40%～50%[15]。在制备鳜鱼ISKNV单克隆抗体研究中，付小哲等[16]主要根据MCP序列来制作抗体，从而使抗体具有特异性识别能力。在非洲猪瘟研究中，黄布敏等[17]也是根据非洲猪瘟病毒（ASFV）的衣壳蛋白进行病毒致病机制分析和疫苗开发。于立等[18]针对鲤科疱疹病毒2型的MCP编码基因序列设计特异性引物，建立了PCR检测方法。因此，本研究根据GenBank中ISKNV衣壳蛋白MCP编码基因（ORF006）保守序列，设计特异性引物及探针，构建了一种ISKNVTaqMan实时荧光定量PCR技术。

荧光定量PCR技术自20世纪80年代由美国科学家发明之后，被广泛应用在生物学研究领域，而TaqMan荧光定量PCR技术发展成熟，具有高特异性、高敏感性、高精确度[19]。本研究设计ISKNV衣壳蛋白MCP编码基因保守序列的引物和探针，通过优化反应体系，提高了方法的灵敏度、特异性以及重复性。本研究建立的方法最低可检测到101copies/μL，是普通PCR的10倍，灵敏度高；操作方便，避免了传统PCR的开盖污染，减少了假阳性[20]；与IHNV、VNNV、LMBV、YCCV、SCRV无交叉反应，特异性好。批内、批间变异系数均小于2.0%，稳定性良好。朱春艳等[21]建立的ISKNV快速PCR方法，最低也可以检测到相同拷贝数，但用时超过3 h，且需要电泳、凝胶成像采集等操作，存在气凝胶污染以及假阴性等问题，操作繁琐、误差大。Lin等[22]建立的鳜鱼ISKNVTaqMan PCR方法对LMBV出现了弱阳性，而本研究方法与LMBV不产生交叉反应，与其相比本研究方法特异性更高。TaqMan荧光定量PCR方法可以根据病毒保守序列设计探针，能够特异性结合目的病毒DNA，是检测病原的最佳方法之一[23]。本研究建立的ISKNVTaqMan荧光定量PCR检测方法，具有操作简便、灵敏度高、重复性好、特异性好、结果准确、耗时短等优点，在临床样品检测中具备可靠性，这对ISKN的早期诊断和控制病毒传播等有重要意义。