山东省某鸭场大肠杆菌病病原的分离鉴定与耐药性分析

袁颖琳，段笑笑，刘宝涛，李 彦

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271000；2.青岛市动物疫病预防控制中心，山东青岛 266000；3.青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109）

肠杆菌是一种常见的条件致病菌，广泛存在于人类和动物胃肠道以及日常环境中。随着抗生素的滥用，肠杆菌已经对部分抗菌药物产生了不同程度的耐药性，这不但严重危害畜牧业的健康持续发展，也严重威胁着公共卫生安全和环境安全。大肠杆菌是埃菌属的代表菌，相对于其他肠杆菌，其对环境要求低，生存能力较强，在普通培养基上便可生长良好，在伊红美蓝培养基中可以形成圆形、湿润的深紫色菌落，并带有典型的绿色金属光泽，常伴有酸臭气味[1]。大肠杆菌病是畜禽常发的疾病，对畜禽养殖产业造成了巨大经济损失。生理功能和免疫力下降的鸭只非常容易被大肠杆菌感染。鸭大肠杆菌病主要表现为关节炎、纤维性气囊炎、输卵管炎等，病鸭全身浆膜呈急性渗出性炎症，心包膜、肝被膜和气囊壁表面附有黄白色纤维素性渗出物[2]。

畜禽大肠杆菌因为血清型复杂多样，无法用疫苗进行预防，临床多采用抗生素进行治疗。由于抗生素的不合理应用，伴随而至的便是细菌耐药率上升和耐药谱不断扩大，并出现多重耐药现象，影响药物治疗效果[3]。大肠杆菌的耐药机制主要包括靶位改变、外膜渗透性障碍、药物外排作用、细菌生物被膜形成以及钝化酶或灭活酶作用等几个方面[4]。不仅如此，含有耐药基因的质粒还可在细菌之间进行接合转移，相互传播，并且畜禽源耐药菌可通过食物链传递给人，严重威胁人类健康[5-6]。

本研究从山东省某鸭场送检至本实验室的病鸭心脏组织病料中分离鉴定大肠杆菌，通过药敏试验分析菌株的耐药谱，并通过PCR检测分析其对β-内酰胺类药物高水平耐药的机制，以期为禽大肠杆菌病临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 病鸭心脏组织病料样本，由山东省某鸭场送至本实验室。病鸭尸体全身浆膜呈急性渗出性炎症，心包膜表面附有纤维素性渗出物。

1.1.2 培养基与试剂 伊红美蓝琼脂、LB肉汤、Mueller-Hinton琼脂、Mueller-Hinton肉汤，均购自青岛海博生物技术有限公司；丙三醇，购自莱阳康德化工有限公司；Easy-TaqDNA Polymerase、10×EasyTaqBuffer、DNA Marker以及dNTP，均购自北京全式金生物科技有限公司；Gel Green核酸染料、琼脂糖，均购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.1.3 药敏试验原料药 头孢噻肟、阿米卡星、链霉素，均购自北京索莱宝生物科技有限公司；头孢噻呋、氨苄西林，均购自上海麦克林生化科技有限公司；黏菌素、环丙沙星，均购自华大科技有限公司；美罗培南，购自东京化成工业株式会社；左氧氟沙星、恩诺沙星、喹乙醇、庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸、多西环素、四环素，均购自中国兽医药品监察所；磷霉素，购自上海瑞永生物科技有限公司。

1.1.4 主要仪器 HVE-50高压灭菌锅，购自日本Hirayama公司；FA1204N分析天平，购自上海双旭电子有限公司；SW-CJ-1C超净工作台，购自成都宜恒实验仪器有限公司；DRP-9162恒温培养箱，购自上海森信实验仪器公司；SN-20制冰机，购自深圳市三利化学品有限公司；5810R离心机，购自德国eppendorf公司；T100PCR仪、凝胶成像仪，均购自美国BIO-RAD公司。

1.2 样品处理

使用高压灭菌后的剪刀剪开组织样品，以无菌棉棒插入组织切面旋转两圈，蘸取切面深部组织；在超净工作台中将棉棒蘸取的组织病料加入到含有1 mL LB肉汤的1.5 mL灭菌离心管中，置于恒温培养箱中37 ℃培养16 h。

1.3 细菌分离与培养

以接种环蘸取培养液划线接种于伊红美蓝琼脂板，置于恒温培养箱中37 ℃培养16～18 h，观察菌落大小、数量、颜色、形态，记录不同形态的菌落；挑取单个疑似菌落接种于伊红美蓝琼脂板进行反复纯化，直至菌落大小、形态均一。挑取单菌落加至含有5 mL LB肉汤的灭菌离心管中，37 ℃培养16 h；取600 μL菌液和60%的甘油肉汤混合均匀（v:v= 1:1），置于-80 ℃保存。

1.4 细菌16S rDNA鉴定

1.4.1 水煮法提取DNA 取1.5 mL菌液，10 000 r/min离心3 min；倒掉上清液，加入1 mL高压灭菌的蒸馏水，充分混匀后将菌体置于沸水中水浴10 min；水浴后迅速插入冰盒中冰浴8 min，然后10 000 r/min离心8 min；将离心后的上清液转移至新离心管中，即为细菌DNA。

1.4.2 PCR扩增 参照文献[7]设计大肠杆菌16S rDNA引物，引物序列见表1。PCR反应体系共15.00 μL：无菌蒸馏水10.55 μL，10×EasyTaqBuffer 1.50 μL，dNTPs 1.20 μL，上下游引物各0.30 μL，Easy-TaqDNA Polymerase 0.15 μL，细菌DNA模板1.00 μL。将PCR产物送青岛派森诺生物技术有限公司测序。

表1 16S rDNA引物序列及其目的片段大小

1.5 抗菌药物敏感性试验

根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）规定的微量肉汤稀释法[8]，测定分离菌对16种药物的最小抑菌浓度（MIC），并根据CLSI标准判断药敏结果。

1.6 blaCTX-M耐药基因鉴定

参考文献[9-10]设计耐药基因引物，对blaCTX-M耐药基因进行PCR扩增，引物序列见表2。PCR体系同细菌16S rDNA鉴定。

表2 耐药基因引物序列及其目的片段大小

blaCTX-M-1G基因PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，49 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共29次循环；72 ℃延伸8 min，保存备用。blaCTX-M-9G基因PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，63 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30次循环；72 ℃延伸8 min，保存备用。取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后置于全自动琼脂糖凝胶成像仪中进行成像，观察DNA目的片段条带大小。

2 结果

2.1 大肠杆菌分离鉴定

观察伊红美蓝琼脂板，可见在深红色的琼脂板上长出表面光滑，呈深紫黑色且带有绿色金属光泽的圆形菌落，疑似为大肠杆菌（图1）。本研究从2只病死鸭病料组织中各获得1株疑似大肠杆菌，共计2株。

图1 鸭内脏组织菌株分离纯化结果

2.2 细菌16S rDNA鉴定

细菌16S rDNA PCR电泳结果（图2）显示，2株分离菌均扩增出大小为1 505 bp的条带，与预期目的条带大小一致。对PCR产物进行测序，然后使用NCBI网站Blast工具，对所得序列进行同源性比对分析。结果显示，2株分离菌分别与大肠杆菌2个序列（GenBank登录号AP024521.1、CP044293.1）同源性为100%。将2株菌分别命名为大肠杆菌CD4-10和CD4-12。

图2 16S rDNA PCR电泳结果

2.3 药物敏感性试验

结果（表3）显示：2株分离菌均对多黏菌素、美罗培南和磷霉素敏感，而CD4-12还对阿米卡星和庆大霉素敏感；2株菌均对头孢噻肟、头孢噻呋、氨苄西林、环丙沙星、左氧氟沙星、恩诺沙星、链霉素、卡那霉素、强力霉素、萘啶酸、氟苯尼考表现耐药；CD4-10对13种药物耐药，CD4-12对11种药物耐药；2株菌对β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类及酰胺醇类药物均表现为5重耐药。

表3 分离菌株药敏试验结果（MIC） 单位：μg/mL

2.4 耐药基因PCR鉴定

PCR结果（图3～4）显示，2株菌均携带β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M-1G，未携带blaCTX-M-9G。结果表明，2株菌对β-内酰胺类药物高水平耐药是因携带blaCTX-M-1G耐药基因造成的。

图3 耐药基因blaCTX-M-1G PCR电泳结果

图4 耐药基因blaCTX-M-9G PCR电泳结果

3 讨论

本试验对送检的2只病死鸭进行剖检，发现病鸭全身浆膜呈急性渗出性炎症，心包膜表面附有纤维素性渗出物，与禽大肠杆菌病病理变化相符。从心脏组织病料中分离到2株细菌，根据培养特性观察以及16S rDNA PCR鉴定，证实分离菌为大肠杆菌，因此确认该鸭场发生了大肠杆菌感染。当环境变差时，禽场易发生大肠杆菌病。大肠杆菌的传播方式及途径多种多样，禽类可经粪便、饮水、饲料、空气、垫草、灰尘、设备、人员、野鸟以及昆虫等被感染[11]。此外，大肠杆菌还常常和其他病原混合感染。因此，应提高畜禽免疫力，提升养殖管理能力，改善环境卫生情况，从而防控大肠杆菌病。

秦春枝等[12]在2020年从山东省分离的禽致病性大肠杆菌中，发现3重及以上耐药菌株最多，占比为91.40%，耐药菌对β-内酰胺类药物头孢噻肟耐药率很高，且有2株菌对所检21种药物均耐药。本试验2株分离菌均对β-内酰胺类药物耐药，进一步证实在畜禽养殖中大肠杆菌对β-内酰胺类药物耐药严重。此外，本试验2株分离菌对β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类及酰胺醇类药物表现为5重耐药，这对该病的临床治疗造成了极大阻碍。值得注意的是，本次试验未发现菌株对多黏菌素和美罗培南耐药。推测其原因可能是：2016年11月1日后多黏菌素被禁止作为促生长添加剂应用于畜牧养殖，从而使多黏菌素耐药率下降；而美罗培南作为人用药并未在畜牧养殖中被应用。随着抗生素的广泛使用，耐药现象越来越严峻。因此，在细菌病治疗过程中要注意合理用药，若继续滥用药物，则治疗效果必然会下降，甚至失去原本药效。

自从德国首次发现blaCTX-M基因以来，CTX-M已形成全球流行性传播，对大肠杆菌病的临床治疗造成了极大阻碍[13-15]。CTX-M根据氨基酸序列差异可分为5大群，即CTX-M-1G、CTX-M-2G、CTX-M-8G、CTX-M-9G和CTX-M-25G。其中CTX-M-1G和CTX-M-9G是当前世界最流行的CTX-M群[16-17]。因此，本试验主要检测这2种CTX-M基因群。经PCR检测，确认2株分离菌均携带blaCTX-M-1G基因。CTX-M酶属于产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），能够将β-内酰胺类药物的β-内酰胺环破坏，导致大肠杆菌等革兰氏阴性菌对此类抗生素产生耐药性。

本试验结果明确该鸭场发生了大肠杆菌病，且分离菌耐药性十分严重，表现为多重耐药，并证实其对β-内酰胺类药物耐药是因携带blaCTX-M-1G基因造成的。参考本试验药敏试验及PCR结果，养殖场应规范使用抗生素，避免出现多重耐药性。在临床的实际用药中，应采用联合、轮换、交叉等用药方式，以达到良好的防治效果[18]。