富有机硒抹茶的化学组成、抗氧化活性及其对DNA损伤的保护作用

李 笑,闫婷玉,牛丽丽,翟盼盼,张华峰,*,杨晓华,彭元金

(1.陕西师范大学 中俄食品与健康科学国际联合研究中心,陕西省汉阴县富有机硒食品科技创新试验示范站,陕西 西安 710119; 2.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院,陕西 西安 710119; 3.西安交通大学 陕西省富硒茶科技创新试验示范站,陕西 西安 710061; 4.长治市综合检验检测中心,山西 长治 046000; 5.紫阳县飞瀑茶业有限公司,陕西 紫阳 725399)

抹茶是经过特殊栽培方式和加工方法制成的粒度不超过18 μm的微粉状茶叶产品,起源于我国,明清时期逐渐被叶芽状茶叶类型(即普通茶叶)取代[1]。抹茶的化学组成、风味与常见的普通茶叶区别较大,具有多种生物活性,被认为是质量最高的茶叶类型[2-3]。近几年,抹茶在我国得到越来越多消费者的认可,在饮料、面点、冷冻食品等领域也显示出广泛的应用前景。

硒是人体必不可少的重要微量元素,缺硒可能会增加人体罹患糖尿病、生殖障碍、癌症等疾病的风险[4-5]。近期的研究发现,硒与新型冠状病毒感染治愈率呈现显著的正相关关系[6]。硒在自然界中以无机硒和有机硒2类形式存在[7]。同无机硒相比,有机硒安全性高,易被人体吸收,更适合作为新一代的硒营养补充剂[6-7]。遗憾的是,迄今鲜见富有机硒食品方面的研究报道。陕西省安康市是我国著名的富硒地区,被誉为“中国硒谷”。安康市盛产的紫阳茶中含有较丰富的硒元素,是陕西省的支柱型富硒农产品[8]。为开发富有机硒食品新产品,促进茶叶精深加工,本课题组开发出了富有机硒抹茶(organic selenium-enriched matcha,OSM)[9-10],并指导建立了陕西省第一条富有机硒抹茶生产线。本研究分析了富有机硒抹茶的主要营养素与活性物质组成,测定了其农药残留与重金属含量,分析了感官特性,并研究了其抗氧化、抗DNA损伤作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

富有机硒抹茶由陕西省紫阳县飞瀑茶业有限公司生产;普通国产抹茶(domestic matcha,DM)和进口抹茶(imported matcha,IM)(非富硒食品)购自西安市超市。农药残留快速检测试剂盒购于中德伯尔生物技术有限公司;表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,纯度≥98%)、抗坏血酸(纯度≥98%)购自西安晶博生物科技有限公司;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)购于美国Sigma-Aldrich有限公司;pBR322质粒、DNA凝胶上样缓冲液购自美国Thermo Fisher科技公司;溴化锭(EB)替代物购于广州捷倍斯生物科技有限公司;琼脂糖购自北京索莱宝科技有限公司;砷(As)、镉(Cd)、铬(Cr)、汞(Hg)、铅(Pb)、铜(Cu)、钼(Mo)、硒(Se)、锶(Sr)、锌(Zn)、铁(Fe)、镁(Mg)、锰(Mn)元素标准液(1.0 mg·mL-1)购自北京普天同创生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 富有机硒抹茶生产工艺

生产工艺流程。在文献调研[11]和试验研究基础上,确定富有机硒抹茶的生产工艺流程如图1所示。

图1 富有机硒抹茶生产工艺流程Fig.1 Manufacture of organic selenium-enriched matcha

生产技术要点:(1)茶树种植园区的选择。选择土壤含硒量高、没有发生过重大地质灾害、没有被工业化学品等污染并且劳动力较充足的地区栽培茶树。(2)栽培管理。在茶树种植过程中需要进行遮阴处理,遮阴时间一般在采收前10～15 d进行,遮光率一般为66%,在实际操作过程中还应根据地理位置、海拔、天气等情况进行适当调整。在必要时可以施用硒肥,但是不能叶面喷洒。(3)采收与贮存。注意采收手法、贮存环境、贮存方式、贮存时间等因素,确保茶叶质量。(4)杀青。采用蒸汽杀青方式,杀青温度控制在(98±2)℃,进叶量要均匀,时间控制在2～3 min。温度、进叶量、时间等因素可根据茶叶遮阴时间和气候环境等因素进行适当调整。(5)超微粉碎。超微粉碎过程中要保持研磨设备温度的恒定和研磨车间的干燥,富有机硒抹茶成品的粒度要符合国家标准规定[12]。(6)成品保藏。制备好的富有机硒抹茶成品要在低温干燥环境中保存,并且贮存场所没有异味和农药等污染。

1.2.2 风味分析方法

电子鼻分析。分别称取普通国产抹茶、进口抹茶和富有机硒抹茶各0.3 g,用5 mL重蒸水溶解后置于35 ℃烘箱中恒温处理1 h,然后用Super Nose型电子鼻(美国ISENSO有限公司)进行检测[13],对实验结果进行线性判别分析(LDA)。

电子舌分析。分别称取3种抹茶样品各5.0 g,用50 mL重蒸水溶解后过滤,将滤液倒入Smart Tongue型电子舌(美国ISENSO有限公司)专用容器中进行检测[13-14],实验结果进行线性判别分析。

感官品鉴。按照文献[11]的方法对3种抹茶进行品鉴打分,通过得分平均值确定感官等级。

1.2.3 多糖、蛋白质、多酚提取方法

参照本实验室优化的方法[15]从抹茶中分离纯化多糖,冷冻干燥后得到抹茶多糖。参考卫萍等[16]的方法从抹茶中分离纯化蛋白质,冷冻干燥后得到抹茶蛋白质。参考杨新等[17]的方法从抹茶中提取多酚,用去离子水反复重结晶后得到抹茶多酚。

1.2.4 蛋白质、氨基酸定量分析方法

用浓硫酸等将抹茶样品消化60 min,冷却后用2300型凯氏定氮仪(丹麦FOSS分析仪器有限公司)测定蛋白质含量[18]。称取抹茶样品0.10 g,加入5 mL 6.00 mol·L-1的HCl,用CEM-MARS6型微波消解仪(美国CEM科技公司)消解30 min,加入相同体积0.50 mol·L-1氢氧化钠溶液,用重蒸馏水定容。用0.45 μm无机膜过滤后,取滤液用L-8900型氨基酸分析仪(日本株式会社Hitachi制作所)对氨基酸进行检测[19]。

1.2.5 表没食子儿茶素没食子酸酯检测方法

抹茶中EGCG含量用U-3000型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher科技公司)测定,配备Aglient C18色谱柱,色谱条件如下:检测波长为280 nm,流动相A为甲醇、B为0.14%磷酸(A∶B体积比28∶72),流速为1.0 mL·min-1,柱温为30 ℃[20-21]。

1.2.6 矿物质与重金属分析方法

称取抹茶样品,加入硝酸后置于微波消解仪中消解,用去离子水定容,然后用5110型电感耦合等离子体发射光谱仪(美国Aglient科技有限公司)进行元素测定[22-24]。

1.2.7 农药残留检测方法

用PR202-10型农药残毒检测仪(厦门欧达科仪发展有限公司)及其配套试剂盒检测抹茶中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留,用相对农药残留量表示农药残留问题的严重程度。当相对农药残留量<50%时,抹茶中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量符合国家标准要求[25]。

1.2.8 体外抗氧化实验方法

总还原力分析。参考Sun等[26]的方法,配制抹茶多糖样品的梯度浓度溶液,加入磷酸缓冲液(PBS缓冲液)和铁氰化钾溶液,混匀后温浴,冷却后立即加入三氯乙酸,经FeCl3溶液处理后用Multiskan Sky 51119770型全波长酶标仪(美国Thermo Fisher科技公司)测定700 nm波长的吸光度。阳性对照为抗坏血酸。

ABTS自由基清除能力分析。参考Zhang等[27]的方法,用相同量的ABTS溶液和过硫酸钾溶液制成ABTS工作溶液。将梯度浓度的抹茶多糖样品溶液与ABTS工作溶液混匀后温浴,用酶标仪测定734 nm波长的吸光度。阳性对照为抗坏血酸。

DPPH自由基清除能力分析。参考Wyrostek等[28]和刘晶等[29]的方法,在避光条件下用无水乙醇配制DPPH试剂。将梯度浓度的抹茶多糖样品溶液与DPPH试剂混匀后温浴,测定514 nm波长的吸光度。阳性对照为抗坏血酸。

1.2.9 DNA损伤实验方法

参考Yang等[30]和叶彤等[31]的方法进行DNA损伤实验。在抹茶多糖组,依次加入PBS缓冲液、FeSO4溶液、H2O2溶液和梯度浓度的3种抹茶多糖溶液(1×10-3、5×10-4、1×10-4mg·mL-1),再加入100 μg·mL-1的pBR322质粒1 μL,在37 ℃水浴中放置30 min后加入上样缓冲液,用DYY-8C型电泳系统(北京六一生物科技有限公司)进行电泳,电泳条件为:先在72 V电压下运行15 min,再在110 V下运行25 min。在阳性对照组中,用抗坏血酸溶液代替抹茶多糖溶液。在阴性对照组中,用PBS缓冲液代替抹茶多糖溶液。电泳结束后,用JS-680B型凝胶成像系统(上海培清科技有限公司)拍照。

1.3 数据分析

采用Origin和Adobe Photoshop软件绘图。所有实验至少重复3次,计算平均值。参考Zhao等[32]和叶彤等[31]的方法计算氨基酸评分(AAS)、氨基酸化学评分(CS)和必需氨基酸占比(E/T)。参照叶彤等[31]的方法计算抹茶多糖清除ABTS和DPPH自由基的50%有效浓度(EC50)和25%有效浓度(EC25)。

2 结果与分析

2.1 富有机硒抹茶的营养物质与活性成分

2.1.1 硒与其他矿物质

由表1可知,富有机硒抹茶和普通国产抹茶、进口抹茶3种样品中均能检出硒元素,3种抹茶提取的多糖、蛋白质中也均可检出硒元素,但是只有富有机硒抹茶的有机硒含量达到了食品安全地方标准《富有机硒食品硒含量要求》(DBS42/002—2022)的规定(有机硒占比80%)[10],其硒多糖和硒蛋白的硒含量分别为0.07、0.47 mg·kg-1,均高于普通国产抹茶和进口抹茶。硒是谷胱甘肽过氧化物酶、硒代磷酸合成酶等的重要组成元素,充足的硒摄入有助于人体抵御流感、艾滋病、新型冠状病毒感染等疾病[7,33]。

表1 三种抹茶主要提取部位的硒含量

有机硒的生物利用度和安全性优于无机硒[6-7]。本研究报道的富有机硒抹茶富含硒蛋白、硒多糖等有机硒,在补硒方面具有较好的应用前景。

由表2可知,富有机硒抹茶的Fe含量显著(P<0.05)高于其他2种抹茶,而Zn、Cu、Sr含量与其他2种抹茶无显著差异(P>0.05),Mn含量显著(P<0.05)低于其他2种抹茶。富有机硒抹茶蛋白质中的Mn含量显著(P<0.05)高于其他2种抹茶,Fe含量显著(P<0.05)高于进口抹茶。富有机硒抹茶多糖中的Sr含量显著(P<0.05)高于进口抹茶。Fe与人体造血功能密切相关,Mn与糖、脂肪代谢有关,Sr可以促进骨骼和牙齿的发育[34-36]。适量食用富有机硒抹茶,有助于人体补充Se、Fe、Zn、Sr等微量元素。

2.1.2 蛋白质与氨基酸

富有机硒抹茶和普通国产抹茶、进口抹茶的总蛋白质含量依次为25.84%和20.80%、35.78%。其中,富有机硒抹茶中检出15种氨基酸,普通国产抹茶、进口抹茶分别检出15、11种氨基酸,富有机硒抹茶、普通国产抹茶和进口抹茶的E/T值依次为34.26%、31.95%、53.27%(表3)。富有机硒抹茶中赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸3种必需氨基酸的含量显著(P<0.05)高于其他2种抹茶,天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸含量也略高于其他2种抹茶(表3)。除亮氨酸外,富有机硒抹茶中其余氨基酸的CS和AAS均高于100(表4),说明其限制氨基酸为亮氨酸。富有机硒抹茶的赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸等必需氨基酸的CS和AAS得分较高(表4)。

表3 三种抹茶中氨基酸的种类与含量

表4 富有机硒抹茶氨基酸评分与化学评分

2.1.3 EGCG

大量研究表明,EGCG具有抗炎症、抗肿瘤等生物活性[37],能够防止高脂饮食诱发的肠道菌群改变,减少DNA链断裂[38]。富有机硒抹茶、普通国产抹茶和进口抹茶中EGCG的含量分别为22.69、16.16、0.83 mg·g-1,富有机硒抹茶中EGCG的含量高于其他2种抹茶。

2.2 富有机硒抹茶的安全性

2.2.1 重金属含量

土壤、空气、水体中的重金属被茶树吸附、吸收后,可能通过茶叶进入人体产生危害。特别是,硒在土壤中可能与镉等重金属存在伴生关系[39]。因此,系统检测富有机硒抹茶尤其是硒蛋白、硒多糖中的重金属显得十分必要。由表5可知,富有机硒抹茶中未检出铅、砷、汞、镉,仅检出少量的铬(0.02 mg·kg-1),但是其含量大大低于国家农业行业标准《茶叶中铬、镉、汞、砷及氟化物限量》(NY659—2003)的规定(铬、镉、汞、砷含量分别不超过5.00、1.00、0.30和2.00 mg·kg-1)[40]。普通国产抹茶的多糖中检出微量铬(0.01 mg·kg-1),进口抹茶的蛋白质中检出少量汞(0.01 mg·kg-1),而富有机硒抹茶的多糖、蛋白质中未检出铬、汞、铅、砷、镉。

表5 三种抹茶主要提取物中重金属含量

2.2.2 有机磷和氨基甲酸酯类农药残留

农药残留对茶叶安全性影响较大[41]。鉴于此,对3种抹茶中有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留量进行了检测,发现富有机硒抹茶的相对农药残留量(1.50%)显著(P<0.05)低于普通国产抹茶(15.3%)和进口抹茶(15.3%),符合食品安全国家标准《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》(GB/T 5009.199—2003)[25]的规定(相对农药残留量低于50%)。

2.3 富有机硒抹茶的感官特性

为评定富有机硒抹茶的感官等级,首先进行人工感官鉴评实验。结果发现,富有机硒抹茶样品的滋味明显优于本实验所用的2种对照抹茶样品,但香气与对照样品没有明显差别。考虑到人工嗅闻、品尝可能具有一定的主观性[42],又采用电子鼻、电子舌对3种抹茶样品进行了感官特性分析。结果表明,3种抹茶样品在香气方面没有太大区别(图2-A),但是在滋味方面存在一定的差异(图2-B),即富有机硒抹茶在滋味方面具有一定的优势,这与人工感官鉴评实验的结果基本一致。

IM、DM、OSM分别表示进口抹茶、普通国产抹茶和富有机硒抹茶。LAD1、LAD2分别表示第一线性判别分析结果、第二线性判别分析结果。下同。IM, DM and OSM represent imported matcha, domestic matcha and organic selenium-enriched matcha, respectively. LAD1 and LAD2 represent the first linear discriminant analysis result and the second linear discriminant analysis result, respectively. The same as below.图2 电子鼻(A)和电子舌(B)分析Fig.2 Assays of electronic nose (A) and electronic tongue (B)

2.4 富有机硒抹茶的抗氧化活性

2.4.1 总还原力

由图3可知,富有机硒抹茶和普通国产抹茶、进口抹茶多糖的总还原力随着多糖质量浓度的增加而升高,呈现出明显的剂量依赖性。质量浓度为0～0.20 mg·mL-1时,抹茶多糖的总还原力增幅显著,当质量浓度超过0.20 mg·mL-1时,总还原力增幅减缓。在3种抹茶中,富有机硒抹茶的总还原力最强,普通国产抹茶次之,进口抹茶最弱。

图3 三种抹茶的总还原力Fig.3 Total reducing capacity of 3 kinds of matcha

2.4.2 自由基清除能力

由图4可知,富有机硒抹茶和普通国产抹茶、进口抹茶多糖对ABTS和DPPH自由基的清除率均随着多糖质量浓度的升高而增加。采用数学方法建立的拟合方程能够较好地反映抹茶多糖与自由基清除率之间的量效关系(表6)。由图4和表6可知,富有机硒抹茶多糖的自由基清除能力明显强于其他2种抹茶。

表6 三种抹茶的ABTS、DPPH自由基清除能力拟合方程

图4 三种抹茶的ABTS和DPPH自由基清除能力Fig.4 Radical-scavenging rate of ABTS and DPPH of 3 kinds of matcha

2.5 富有机硒抹茶的抗DNA损伤活性

pBR322质粒在正常情况下为超螺旋型结构,当其受到损伤时可能出现开环形结构、线型结构[28]。由图5可见,阴性对照组DNA全部为开环形结构(泳道1),加入富有机硒抹茶多糖后,开环型DNA数量减少,而超螺旋型DNA数量增加,并且随着富有机硒抹茶多糖质量浓度的升高,超螺旋型DNA数量逐渐增加,呈现出明显的剂量依赖关系(泳道8～10),说明富有机硒抹茶多糖具有一定的体外抗DNA损伤活性。普通国产抹茶多糖(泳道5～7)和进口抹茶多糖(泳道2～4)也显示出一定的抗DNA损伤活性。当抹茶多糖质量浓度为1×10-3g·mL-1时,富有机硒抹茶多糖处理后的超螺旋型DNA数量明显多于普通国产抹茶和进口抹茶多糖,说明与其他2种抹茶多糖相比,富有机硒抹茶多糖对DNA损伤具有更强的保护作用。茶是重要的药食同源植物[43]。唐代《千金食治》指出,茶“可久食,令人有力,悦志,微动气。”《新修本草》指出,茶“主瘘疮,利小便,去淡、热渴,令人少睡”;现代药理学研究发现,茶具有抗癌、降血糖、调节免疫等作用[43-44]。DNA损伤可能导致癌症、糖尿病、免疫低下等疾病[45-46]。本研究发现,抹茶多糖具有较好的抗DNA损伤作用,这可能是茶抗肿瘤、降血糖、调节免疫的作用机制之一,今后可进一步探究富有机硒抹茶多糖的抗DNA损伤活性及其他生物活性。

泳道1,阴性对照组;泳道2～4,1×10-3、5×10-4、1×10-4 g·mL-1进口抹茶多糖组;泳道5～7:1×10-3、5×10-4、1×10-4 g·mL-1普通国产抹茶多糖组;泳道8～10:1×10-3、5×10-4、1×10-4 g·mL-1富有机硒抹茶多糖组。In the electrophoretogram, the upper, medial and lower bands represent the open-circular, linear and supercoiled DNAs, respectively. Lane 1, Negative group; Lane 2-4, 1×10-3, 5×10-4 and 1×10-4 g·mL-1 IM polysaccharides groups; Lane 5-7, 1×10-3, 5×10-4 and 1×10-4 g·mL-1 DM polysaccharides groups; Lane 8-10, 1×10-3, 5×10-4 and 1×10-4 g·mL-1 OSM polysaccharides groups.图5 三种抹茶对DNA损伤的保护作用Fig.5 Protective effect of 3 kinds of matcha against DNA damage

3 结论

同无机硒相比,有机硒在安全性和生物利用度方面具有较大的优势。开发富有机硒抹茶新产品,分析其营养组成、生物活性与安全性,有助于促进茶叶资源开发利用。本研究报道了新型富有机硒抹茶的化学组成及其抗氧化、抗DNA损伤活性。富有机硒抹茶样品的有机硒含量达到了富有机硒食品标准,其硒多糖、硒蛋白的硒含量高于普通国产抹茶和进口抹茶样品,此外还含有较丰富的Fe、Zn、Sr等微量元素。富有机硒抹茶中赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸3种必需氨基酸和EGCG含量显著高于其他2种抹茶。富有机硒抹茶样品及其蛋白质、多糖中未检出铅、砷、汞、镉,其相对农药残留量显著低于其他2种抹茶样品,符合食品安全国家标准。富有机硒抹茶样品的滋味明显优于普通国产抹茶和进口抹茶样品,而香气与其他2种抹茶样品没有明显差别。富有机硒抹茶多糖显示出较强的抗氧化、抗DNA损伤活性。本研究为富有机硒抹茶营养保健作用与物质基础的阐明提供了参考依据。富有机硒抹茶富含有机硒,具有一定的营养价值和生物活性,值得进一步研究开发。