梨火疫病防治用药对意大利蜜蜂的急性毒性与风险评价

班 学,马翔宇,张飞鹏,张王斌

(塔里木大学 农学院,新疆 阿拉尔 843300)

库尔勒香梨(Pyrussinkiangensisyu)是新疆农业发展的支柱产业之一,在农业结构调整、农民增收脱贫中发挥着重要作用[1]。香梨是典型的虫媒授粉作物,蜜蜂授粉是促进香梨增产提质的重要措施[2]。梨火疫病在香梨整个生育期均会不同程度地发生,若防治不当,将对香梨的产量和质量产生极大的影响[3]。化学农药是目前防治梨火疫病的主要措施,但果树花粉和花蜜很容易因受到农药污染而导致蜜蜂中毒死亡,继而影响香梨授粉的顺利进行[4]。因此,如何处理好梨火疫病农药防治与蜜蜂授粉之间的矛盾是新疆香梨生产中亟须解决的问题。

近年来,世界各地的蜜蜂蜂群普遍出现了严重的势量衰竭失调现象,科学家们称之为蜂群崩溃综合征(colony collapse disorder, CCD),但关于引起蜂群势量衰退的主要原因,学界仍有争议[5]。贾变桃等[6]认为,引起蜂群衰退的因素很多,其中,农药的大量使用是一个重要诱因。赵帅等[7]研究了300种农药制剂,发现其中74%以上的杀虫剂对蜜蜂具有高毒或剧毒毒性,但大多数杀菌剂对蜜蜂相对安全。近年的研究发现,部分杀菌剂与其他农药具有协同增效的作用,但对蜜蜂的毒性加剧,破坏蜜蜂种群的多样性及其为蜜源植物授粉的可持续性[8]。Fisher等[9]研究发现,吡唑醚菌酯与啶酰菌胺的复配剂可引起意大利蜜蜂蛋白质缺乏,营养不良,导致蜂群中的工蜂寿命缩短,工蜂数量下降15%,严重影响蜂群积极越冬。此外,大多数内吸性杀菌剂被植物吸收后还可引起花粉和花蜜的污染,极易对成蜂和幼虫的生理生化和行为产生影响,如引起成年工蜂分工不明显、巢房清洁行为减少、运动功能紊乱等,干扰蜜蜂神经系统,影响蜜蜂正常生长发育和繁殖,损害其记忆、学习能力,以及采集归巢的能力等[10-12]。王康等[13]研究证明,多菌灵农药胁迫会导致蜜蜂保幼激素滴度上升,蜕皮激素滴度显著下降,直接干预幼虫的稳定发育,造成蜜蜂化蛹延迟。这会对蜜蜂的健康发育和蜂群的稳定和维持构成潜在威胁。

目前,国内关于农药对意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)急性毒性的研究虽然较多,但绝大多数研究仅评价了新烟碱类、植物源类和昆虫生长调节剂类杀虫剂对意大利蜜蜂的生态风险,忽视了杀菌剂对蜜蜂生理和行为的影响[14-15]。除杀虫剂外,杀菌剂也是蜜蜂最常接触的一类化学物质。杀菌剂常喷施在对采集蜂有吸引力的蜜源作物上,极易造成采集蜂的农药中毒死亡[16],因此应注重开展杀菌剂对蜜蜂毒性、作用机制等方面的研究。这样不仅有利于对授粉蜜蜂种质资源多样性的保护,而且对新疆地区养蜂业、授粉业和香梨产业的健康可持续协调发展具有积极的推进作用。为此,本研究根据杀菌剂的作用机制和化学结构,选择梨火疫病防治中常用的7种杀菌剂作为供试药剂,以意大利蜜蜂为受试对象,参照国家标准GB/T 31270.10—2014《化学农药环境安全评价试验准则 第10部分:蜜蜂急性毒性试验》[17]在室内采用连续摄入法和接触法测定其对蜜蜂24、48 h的急性经口和接触毒性,旨在明确7种杀菌剂对意大利蜜蜂的急性毒性,并通过危害熵值(HQ)初步评价其对意大利蜜蜂的生态风险,以期通过合理选择梨火疫病防治用药来减轻或避免意大利蜜蜂在授粉期间受到的毒性影响,同时为开展杀菌剂对意大利蜜蜂的安全性评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试蜜蜂

试验用的意大利蜜蜂从新疆维吾尔自治区阿拉尔市一师九团罗斌养蜂场购入,并由塔里木大学农学院繁殖和驯养。选择同一蜂群健康状况一致的成年工蜂开展试验。用于急性经口毒性试验的蜜蜂需要在黑暗条件下提前饥饿2 h。

1.1.2 供试药剂

45%(质量分数,下同)中生菌素原药(简记为药剂A),陕西麦克罗生物科技有限公司;85%春雷霉素原药(简记为药剂B),陕西麦克罗生物科技有限公司;3%中生菌素可溶液剂(简记为药剂C),福建凯立生物制品有限公司;4%春雷霉素水剂(简记为药剂D),山西新源华康化工股份有限公司;3%噻霉酮微乳剂(简记为药剂E),江苏辉丰生物农业股份有限公司;47%春雷·王铜可湿性粉剂(简记为药剂F),一帆生物科技集团有限公司;0.3%四霉素水剂(简记为药剂G),辽宁微科生物工程股份有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

试验蜂笼为17 cm×5.5 cm×12 cm的长方体透明塑料盒,顶部设有饲喂口和通风口,不重复使用。昆虫室,面积10.8 m2。

大型仪器设备包括:AL204型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;MGC-450HP型人工气候培养箱,上海一恒科学仪器有限公司;晶弘BCD-220EGK型冰箱,合肥晶弘电器有限公司。

1.2 试验方法

参照国家标准GB/T 31270.10—2014,采用连续摄入法和接触法2种方法,分别测定7种供试杀菌剂对意大利蜜蜂的急性经口和接触毒性。试验温度为(26±2)℃,相对湿度60%～70%,于黑暗条件下进行。

1.2.1 急性经口毒性试验

根据预试验初步确定意大利蜜蜂的最高全存活浓度和最低全致死浓度,在此范围内,用50%蔗糖溶液以一定的级差(通常级差小于2.2)将供试药剂配制成5个正式试验浓度。将供试蜜蜂引入试验蜂笼中,将提前配好的蜜药装入10 mL小烧杯中,杯内浸渍0.5 g脱脂棉,杯口向下固定置于试验笼纱网上供蜜蜂取食,及时添加药蜜。每组重复3次,每组重复10只蜜蜂,并设置对照组。观察并记录蜜蜂24、48 h的中毒症状和死亡情况。

1.2.2 急性接触毒性试验

根据预试验初步确定意大利蜜蜂的最高全存活浓度和最低全致死浓度,在此范围内,用蒸馏水以一定的级差(通常级差小于2.2)将供试药剂配制成5个正式试验浓度。将意大利蜜蜂低温麻醉后,用移液器取1 μL不同浓度的供试药剂点滴在供试蜜蜂的前胸背板处,待蜂身晾干后移入试验笼,以50%蔗糖溶液不限量饲喂。每组重复3次,每组重复10只蜜蜂,并设置对照组。观察并记录蜜蜂24、48 h的中毒症状和死亡情况。

1.2.3 急性毒性试验质量要求

(1)低温麻醉后,蜜蜂无死亡。(2)以96%乐果(dimethoate)原药作为参照药剂进行可信度试验,其单只蜜蜂在24 h的接触半致死剂量(LD50)应在0.10～0.30 μg(以有效成分计,下同),且对照组蜜蜂死亡率不可超过10%。

1.2.4 毒性判定标准

参照GB/T 31270.10—2014,基于致死中浓度(LC50)或单只蜜蜂的LD50划分4个等级:(1)剧毒,LC50≤0.5 mg·L-1或LD50≤0.001 μg;(2)高毒,0.5 mg·L-1200 mg·L-1或LD50>11.0 μg。

1.3 风险评价

基于联合国粮食及农业组织(FAO)、国际经济及合作组织(OECD)、欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)采用的HQ(即农药田间施用量与测定的LD50之比)[18-20]来评价供试农药对意大利蜜蜂的生态风险。根据HQ的数值划分3个等级:HQ≤50,对蜜蜂低风险;502 500,对蜜蜂高风险。

1.4 数据处理

采用Excel 2013软件记录、整理数据。用SPSS 23.0软件计算相应的LC50、LD50、95%置信限,拟合线性回归方程,开展方差分析(ANOVA),对有显著(P<0.05)差异的,采用LSD(最小显著差数)法进行多重比较。使用Origin 2021软件制图。

2 结果与分析

2.1 意大利蜜蜂的中毒症状

经供试杀菌剂暴露处理后,意大利蜜蜂均表现出中毒症状(图1)。接触四霉素的蜜蜂出现双翅张开、行动不稳、喙伸展和侧躺死亡等中毒症状,接触噻霉酮的蜜蜂大多出现拒食、体重减轻、腹部膨大和体色发黑等中毒症状,接触春雷霉素和中生菌素的蜜蜂出现喙伸展、行动迟缓和身体侧躺抽搐等中毒症状。总体来看,供试杀菌剂引起的意大利蜜蜂中毒症状基本相似,主要症状表现为喙伸展、双翅张开、腹部膨大、体缩、体色发黑和散发出恶臭味等;但个别药剂也有不同,如接触春雷·王铜的蜜蜂除有上述中毒症状,还有明显的吐液现象。

图1 意大利蜜蜂中毒的主要症状表现Fig.1 Main symptoms of Italian honeybees (Apis mellifera ligustica) with pesticide poisoning

2.2 杀菌剂对意大利蜜蜂的致死效果

随着药剂浓度(用量)的不断增加,各供试药剂对意大利蜜蜂的致死率均明显升高(表1),且供试杀菌剂对蜜蜂的急性毒性均随着时间的延长而增大,48 h平均死亡率全部高于24 h平均死亡率,表明杀菌剂对蜜蜂的急性毒性具有时间增长效应。

表1 杀菌剂对意大利蜜蜂的急性毒性试验结果

2.3 杀菌剂对意大利蜜蜂的急性毒性

2.3.1 急性经口毒性

采用连续摄入法检测7种杀菌剂对蜜蜂的急性经口毒性(表2)。根据其48 h的LC50判断,供试药剂对蜜蜂的急性经口毒性由大到小依次为0.3%四霉素水剂>3%噻霉酮微乳剂>47%春雷·王铜可湿性粉剂>3%中生菌素可溶液剂>45%中生菌素原药>4%春雷霉素水剂>85%春雷霉素原药。参照GB/T 31270.10—2014,判定45%中生菌素原药、85%春雷霉素原药和4%春雷霉素水剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性为低毒,3%中生菌素可溶液剂、3%噻霉酮微乳剂、47%春雷·王铜可湿性粉剂和0.3%四霉素水剂为中毒。

表2 杀菌剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性

2.3.2 急性接触毒性

通过接触法测定7种杀菌剂对蜜蜂的急性接触毒性(表3)。根据其48 h的LD50判定,供试药剂对蜜蜂的急性接触毒性由大到小依次为0.3%四霉素水剂>3%噻霉酮微乳剂>3%中生菌素可溶液剂>4%春雷霉素水剂>45%中生菌素原药>47%春雷·王铜可湿性粉剂>85%春雷霉素原药。参照GB/T 31270.10—2014,7种杀菌剂中除0.3%四霉素水剂被判定为中毒,其余供试药剂对意大利蜜蜂的急性接触毒性均为低毒。

表3 杀菌剂对意大利蜜蜂的急性接触毒性

2.4 风险评价

通过急性接触毒性试验的48 h LD50来计算HQ(表4)。4%春雷霉素水剂、3%中生菌素可溶液剂和47%春雷王铜可湿性粉剂对意大利蜜蜂的HQ均小于50,说明其在田间按推荐用量施用对蜜蜂的风险较低;3%噻霉酮微乳剂和0.3%四霉素水剂对意大利蜜蜂的HQ在50～2 500,说明其在田间按推荐用量施用对蜜蜂的风险中等。总的来看,0.3%四霉素水剂在田间施用对意大利蜜蜂的生态风险最高。

表4 杀菌剂对意大利蜜蜂的接触危害熵值(HQ)

3 讨论

本研究中,参照药剂96%乐果原药对意大利蜜蜂的急性接触试验24 h LD50值为0.243 μg,符合GB/T 31270.10—2014的相应要求,说明受试意大利蜜蜂的敏感性和质量符合要求,既可用于急性经口毒性试验,也可用于急性接触毒性试验,试验方法和体系有效可靠。

本研究分别采用连续摄入法和接触法对意大利蜜蜂进行急性毒性测定,从结果看,45%中生菌素原药、85%春雷霉素原药和4%春雷霉素水剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性和接触毒性均为低毒;0.3%四霉素水剂对意大利蜜蜂的急性经口和接触毒性均为中毒;3%中生菌素可溶液剂、3%噻霉酮微乳剂和47%春雷·王铜可湿性粉剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性为中毒,但急性接触毒性为低毒。可见,供试杀菌剂对意大利蜜蜂的急性毒性不尽相同,大部分杀菌剂的急性经口毒性大于急性接触毒性,这可能是由于在不同的试验中进入蜜蜂体内的农药暴露剂量不同,因而造成其毒性存在明显差异。

中生菌素为N-糖苷类碱性水溶性杀菌剂,主要抑制蛋白质肽键的合成,降低细胞酶活性,具有抑制和触杀作用。中生菌素原药对意大利蜜蜂的急性经口毒性和接触毒性均为低毒,但本研究选用的中生菌素制剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性为中毒,接触毒性为低毒。赵帅等[7]研究发现,同样有效成分的不同剂型对蜜蜂的急性毒性结果存在很大差异,其原因可能是制剂里含有的助剂、溶剂等改变了农药的附着性和渗透性,从而导致蜜蜂受到的农药暴露剂量不同。春雷霉素为氨基糖苷类杀菌剂,主要抑制氨酰tRNA与信使RNA(mRNA)核糖体蛋白复合物的结合,从而阻碍蛋白质翻译的启动,导致细胞颗粒化,具有内吸和渗透作用。本试验选用的85%春雷霉素制剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性和接触毒性均为低毒,与王宏栋等[15]对地熊蜂(Bombusterrestris)接触毒性的测定结果一致,但对比得到的LD50值,仍存在些许差异。这既可能是因为意大利蜜蜂和地熊蜂的敏感性存在差异,也可能是由不同厂商的生产工艺差异所造成。噻霉酮为有机杂环类噻唑啉酮杀菌剂,主要干扰细胞呼吸和腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的合成,抑制细胞呼吸和能量合成,干扰菌体正常新陈代谢,具有触杀和渗透作用。本试验中噻霉酮制剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性为中毒,但急性接触毒性为低毒。由此可知,即使是同种制剂,但受特定的作用方式和作用机制影响,蜜蜂最终面对的农药暴露剂量也不相同,测定的急性经口毒性和接触毒性结果也会有一定的差异。春雷·王铜是春雷霉素和氢氧化铜混配的复合型杀菌剂,主要干扰氨基酸代谢的酯酶系统,妨碍病菌能量合成,以抑制作用为主,并兼具内吸性。本试验中春雷·王铜制剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性为中毒,但急性接触毒性为低毒。这与韩文素等[21]的研究结论基本相似,单剂与不同作用机制的药剂复配会增强其对意大利蜜蜂的急性毒性。四霉素是四烯大环内酯类杀菌剂,属于麦角甾醇生物合成抑制剂(ergosterol biosynthesis inhibitors, E-BIs),主要抑制麦角甾醇生物合成C-14脱甲基化酶形成抗生素甾醇复合物,破坏孢子形态和细胞膜结构,并抑制细胞色素P450解毒活性,从而提高杀菌剂的毒性,具有抑制和渗透作用。本试验中四霉素制剂对意大利蜜蜂的急性经口毒性和接触毒性均为中毒,这可能是由于四霉素长时间在蜜蜂体内积累,导致其甾醇合成持续受到抑制,药剂毒性随之增强。张勇等[22]研究表明,氟环唑对意大利蜜蜂的急性经口毒性和接触毒性均为高毒。贾变桃等[6]研究表明,抑霉唑和丙环唑对意大利蜜蜂的急性经口毒性为中毒,咪鲜胺和丙环唑的急性接触毒性为中毒,氟硅唑为高毒。廖秀丽等[23]研究发现,代森锰锌对小峰熊蜂(Bombushypocrita)和红光熊蜂(Bombusignitus)的急性经口毒性和接触毒性均为高毒,且毒性高于氟虫脲和毒死蜱。可见,杀菌剂对蜜蜂的毒性风险并不一定小于杀虫剂,应当慎重使用。

本研究采用HQ来评价供试药剂对蜜蜂的生态风险。4%春雷霉素水剂、3%中生菌素可溶液剂和47%春雷·王铜可湿性粉剂对意大利蜜蜂表现出低风险,3%噻霉酮微乳剂和0.3%四霉素水剂表现为中风险。整体来看,大多数供试杀菌剂对意大利蜜蜂表现出低毒低风险和中毒中风险的趋势,这与张艳峰等[24]的研究结论基本一致。从HQ的计算方式也可以看出,该值一方面取决于田间施用量,另一方面取决于农药对意大利蜜蜂的急性接触LD50值,因此急性毒性是评价农药对蜜蜂生态风险的决定性因素之一[25]。在急性毒性数据的基础上引入药剂的田间施用量,可以更准确、更直观地反映出供试药剂对蜜蜂的生态风险。这也说明,严格把控农药的田间使用量,是降低农药对蜜蜂毒性风险的有效措施。因此,库尔勒香梨生产中可优先选择中生菌素、春雷霉素、春雷·王铜这3种低风险农药来防治梨火疫病。当施用噻霉酮、四霉素时,应采取相关措施降低其对蜜蜂的毒性风险。

在实际的田间应用中,各种剂型农药在田间的性质、实际用量和田间用药操作行为,以及环境因素,都会影响农药对蜜蜂的毒性;因此,要科学评价农药对蜜蜂的毒性,还必须考虑农药残留对田间蜜蜂的影响,除了强调蜜蜂的急性死亡终点指标,还需关注由慢性中毒引起的蜜蜂生理和生态行为变化。今后,应在现有急性毒性的研究基础上,适时开展农药对蜜蜂的慢性毒性研究。这对于全面准确地评价农药对蜜蜂的毒性风险具有积极的现实意义。