大脑皮层MANF和NF-κB p65表达及其在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用

周道英,尹 号,韩明明,杨成伟,李振宇,宋 尧,黄 祥,康 芳,李 娟

脑卒中是临床常见病,死亡率和致残率高,其中缺血性脑卒中占60%～70%[1]。目前缺血性脑卒中主要治疗方法为静脉溶栓和血管内治疗,但血管再通后缺血性脑卒中区域血供的恢复会导致一系列不良的生化反应,引起脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia-reperfusion injury,CIRI)[2]。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)是一种新型的神经营养因子,研究认为MANF在CIRI中具有脑保护作用[3],但其具体的作用机制尚不明确。核转录因子(NF)-κB是一种重要的转录调控因子,其在兔关节炎症模型中可通过抑制NF-κB信号通路,降低靶基因表达,减轻关节炎症反应。本研究拟观察脑皮层MANF和NF-κB p65表达在大鼠CIRI中作用,以期为缺血性脑卒中的防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物与分组 清洁级健康雄性SD大鼠30只,6～8周龄,体质量200～230 g,购自安徽省立医院实验动物中心。所有大鼠均于实验前在标准化实验室鼠笼中适应性喂养1周。采用随机数字表法分成假手术组(Sham组)和缺血再灌注组(I/R组),各15只。所有实验操作已获中国科学技术大学附属第一医院动物伦理委员会批准,审批号:2021-N(A)-82。

1.1.2 主要试剂 2,3,5-三苯基四氮唑(TTC)磷酸盐缓冲液购自上海生工生物工程股份有限公司;MANF、GAPDH、CHOP抗体购自美国Sigma公司;NF-κB p65抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;SDS-PAGE缓冲液购自上海碧云天生物技术有限公司;HRP标记的羊抗兔/鼠IgG二抗购自上海艾比玛特医药科技有限公司;TUNEL试剂盒购自美国Roche公司;ELISA试剂盒购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大脑中动脉闭塞模型建立 I/R组大鼠采用改良线栓法制备大鼠局灶性CIRI模型[4],1%异氟醚吸入麻醉,取颈部腹侧正中切口分离颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,结扎颈总动脉近心端、颈外动脉根部,将事先头端钝化处理后的线栓(直径为0.235 mm的尼龙线)缓慢从颈总动脉插入颈内动脉,感受到稍有抵抗感时停止(插入深度约18～20 mm),结扎颈外动脉,阻闭大脑中动脉。缝合切口,术后切口周围局部注射1%利多卡因进行镇痛,栓塞2 h后,将线栓拔出少许使插入深度约15 mm,开始大脑中动脉再灌注。Sham组不将线栓插入颈内动脉,其余处理方法同I/R组。术中使用保温毯维持大鼠体温37～38 ℃,麻醉苏醒后单笼饲养,自由摄食。

1.2.2 神经功能缺损评分(Longa)法评估神经功能 再灌注24 h时各组随机取6只大鼠,由一位不熟悉分组的实验人员采用Longa 5分制评分标准[5]对大鼠进行神经功能损伤评分,总分0～4分。Longa评分标准:0分,无神经功能缺损症状;1分,无法伸直左侧前爪,神经功能轻度障碍;2分,大鼠走动时向对侧(瘫痪侧)转圈,神经功能中度障碍;3分,大鼠走动时身体向对侧(瘫痪侧)倾倒,神经功能重度障碍;4分,不能自发行走,意识丧失。评分越高,说明神经功能损伤越严重。建模成功大鼠评分1～3分,去除0分和4分,模型制作成功率93.4%,模型在实验中随机补全,以确保每组大鼠的数量保持不变。

1.2.3 头颅磁共振扫描(MRI)观察脑梗死灶 神经功能评估后的6只大鼠,在麻醉下以俯卧位放入MRI磁体孔内,头部固定在7.62 cm的表面线圈内,MRI在美国GE公司3.0T Sigma HDX MRI扫描仪上进行。在T2加权成相上观察脑缺血梗死灶,证实造模成功。

1.2.4 TTC染色检测脑梗死体积 6只大鼠MRI扫描后,在深麻醉下快速断头取脑,新鲜脑组织用0.9%氯化钠溶液冲洗后立即放入-20 ℃冰箱15 min,脑组织去除小脑及低位脑干后,沿着冠状面将大脑切成2 mm厚度冠状切片,将脑切片立即放入2%的TTC磷酸盐缓冲液中,在37 ℃温箱中避光孵育15 min,正常脑组织被染为红色,而梗死区域脑组织不能被TTC染料染色则呈现白色。将已染色的脑切片按顺序规律摆放,扫描仪扫描后用Image J图像处理软件分析,测定脑梗死面积。梗死体积百分比=(梗死对侧正常脑组织体积-梗死侧正常脑组织体积)/梗死对侧正常脑组织体积×100%。

1.2.5 HE染色法检测大脑皮层组织病理学变化 2组各取5只大鼠,在深麻醉下快速断头取脑,取脑组织,于4%多聚甲醛溶液中固定,脱水,石蜡包埋,连续冠状切片,厚约4 μm,置于-80 ℃超低温冰箱中保存待用。取各组大鼠脑组织石蜡切片,进行HE染色,封片后显微镜下(×200)观察缺血区域大脑皮层的组织病理学变化和细胞损伤情况。

1.2.6 Western blotting法检测大脑皮层MANF、NF-κB p65表达 于再灌注24 h时,各组随机取4只大鼠,在深麻醉下快速断头取脑,心脏采血待用。取同侧大脑皮层缺血半暗带,称质量后加入含有蛋白酶抑制剂的组织裂解缓冲液RIPA,于冰上匀浆裂解30 min,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,取上清,按比例加入上样缓冲液后,90 ℃水浴加热5 min,-20 ℃冷冻保存。取适量蛋白上样,经SDS-PAGE电泳分离,湿转法转至PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1 h,加入一抗MANF(1∶1 000稀释)、NF-κB p65(1∶1 000稀释)、GAPDH(1∶1 000稀释),4 ℃下孵育过夜,洗膜后HRP标记的羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶3 000稀释)室温孵育1 h,洗膜后化学发光显影,用Image J图像处理软件分析,以GADPH为内参,通过与内参的灰度值比,得出目的条带的相对表达水平,测定MANF与NF-κB p65蛋白表达水平。

1.2.7 免疫组织化学染色法检测大脑皮层MANF、NF-κB p65、CHOP表达 取2组大鼠脑组织石蜡切片,经脱蜡、水化、抗原修复、封闭后,分别滴加MANF抗体(1∶400稀释)、NF-κB p65抗体(1∶400稀释)和CHOP抗体(1∶50稀释),按免疫组织化学ABC法染色后,DAB显色,苏木素复染,二甲苯透明,中性树胶封片,于光镜下(×200)观察。细胞质或细胞核呈棕黄色染色为免疫阳性细胞,每张切片于高倍镜下随机选取梗死灶边缘区域相互不重叠的5个视野,计数MANF、NF-κB p65、CHOP表达阳性细胞。

1.2.8 免疫荧光染色法检测大脑皮层MANF和NF-κB p65亚细胞定位 取各组大鼠脑组织石蜡切片,二甲苯脱蜡,PBS清洗3次,柠檬酸修复液修复抗原,修复后用10%山羊血清封闭(37 ℃,30 min),滴加一抗MANF(1∶50稀释)及NF-κB p65(1∶800稀释)混合于脑组织上,4 ℃孵育过夜,室温复温30 min,洗去一抗,滴加与一抗同一来源的二抗荧光显色(MANF绿色、NF-κB p65红色),37 ℃避光孵育1 h,洗去二抗,加含DAPI(蓝色)的抗荧光淬灭剂复染细胞核5 min,最后用甘油封片,共聚焦显微镜下(×400)观察缺血区域大脑皮层MANF和NF-κB p65亚细胞定位。

1.2.9 TUNEL染色法检测大脑皮层细胞凋亡 取各组大鼠脑组织石蜡切片,常规脱蜡、水化、抗原修复后,将切片与TUNEL试剂混合液室温避光孵育1 h。PBS洗涤后,用DAPI核染色剂观标记细胞核。TUNEL染色结束后滴加抗荧光淬灭剂封片,使用荧光显微镜观察(×200)并拍照记录。在每个切片中随机选择缺血区域大脑皮层5个不同视野记录TUNEL染色(绿色)阳性细胞数,并计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=阳性细胞数/细胞总数×100%。观察缺血区域大脑皮层的细胞凋亡情况。

1.2.10 ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平 将收集的大鼠血液室温静置40～60 min,静置待血液析出血清后4 ℃ 3 000 r/min离心10 min,收集上层无色或淡黄色血清样品。应用ELISA试剂盒,设置标准品孔、空白孔及样品孔,标准品孔加50 μL梯度稀释的标准品,样品孔加入50 μL适当稀释的样品,振荡混匀后封板,37 ℃孵育30 min,洗涤液清洗5次,除空白孔外每孔加50 μL酶结合工作液,混匀后封板,37 ℃孵育1 h,洗涤液清洗5次,然后每孔加100 μL显色液,混匀后37 ℃避光显色20 min,在标准品孔出现颜色梯度变化时,每孔加50 μL终止液,15 min内在酶标仪上于450 nm处以空白孔调零后测各孔吸光度值(OD值),测定血清样品中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平,实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用t检验和秩和检验。

2 结果

2.1 2组大鼠神经功能缺损评分和组织学表现 2组大鼠术前神经功能缺损评分均为0分;术后24 h,Sham组神经功能缺损评分仍为0分,I/R组大鼠神经缺损功能评分高于Sham组(P<0.05)。大鼠头颅MRI及TTC染色结果提示,与Sham组比较,I/R组脑梗死体积明显增加(P<0.01)(见表1)。

表1 2组大鼠Longa评分和脑梗死体积比较[M(P25,P75)]

光镜下,Sham组大鼠大脑皮层可见大量神经细胞,排列整齐密集,形态规则,细胞核完整、大而圆,细胞质丰富;I/R组大鼠缺血侧大脑皮层可见神经细胞数量减少,排列杂乱疏松,细胞核深染、固缩、碎裂,细胞质肿胀,部分细胞呈空泡样改变,大脑皮层明显水肿(见图1)。神经功能缺损评分、脑梗死体积比较和HE染色结果均表明I/R组大鼠模型建立成功。

2.2 2组大鼠大脑皮层MANF和NF-κB p65蛋白表达及亚细胞定位 与Sham组比较,I/R组大鼠缺血侧大脑皮层MANF和NF-κB p65蛋白表达均上调(P<0.01和P<0.05)(见表2),I/R组大鼠缺血侧大脑皮层MANF、NF-κB p65和CHOP免疫阳性细胞数均明显增多(P<0.01)(见表3)。Sham组大鼠大脑皮层MANF(绿色)和NF-κB p65(红色)主要在细胞质中表达;I/R组大鼠缺血侧大脑皮层MANF和p65都发生了细胞核易位,并共定位于细胞核中(见图2)。

表2 2组大鼠大脑皮层MANF和NF-κB p65蛋白比较

表3 2组大鼠大脑皮层MANF、NF-κB p65和CHOP免疫阳性细胞数比较个)

2.3 2组大鼠大脑皮层细胞凋亡情况及炎症反应 I/R组大鼠脑缺血侧大脑皮层细胞凋亡率为(54.80±3.88)%,明显高于Sham组的(8.23±1.10)%(t=25.82,P<0.01)。I/R组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均明显高于Sham组(P<0.01)(见表4)。

表4 2组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

光镜下,Sham组大鼠大脑皮层可见大量神经细胞,排列整齐密集,形态规则,细胞核完整、大而圆,细胞质丰富;I/R组大鼠缺血侧大脑皮层可见神经细胞数量减少,排列杂乱疏松,细胞核深染、固缩、碎裂,细胞质肿胀,部分细胞呈空泡样改变,大脑皮层明显水肿(见图1)。神经功能缺损评分、脑梗死体积比较和HE染色结果均表明I/R组大鼠模型建立成功。

3 讨论

Longa改良线栓法[4]是目前CIRI研究中最常用的技术,该方法具有恒定的缺血部位,可用于再灌注,模拟人类永久性和暂时性局灶性脑缺血的不同状态[6]。本研究建立I/R组大鼠脑缺血模型,结果显示,Sham组大鼠神经功能正常,头颅MRI及脑组织TTC染色未见梗死灶,I/R组神经功能缺损评分高于Sham组,头颅MRI及脑组织TTC染色可见明显脑梗死灶,HE染色可见大脑皮层神经细胞数量减少,排列杂乱疏松,皮层明显水肿,呈液化性坏死,这些结果均表明局灶性脑梗死灶模型建立成功。

MANF是一种进化保守的新型神经营养因子,具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡等作用[7-9]。正常生理状态下,MANF主要表达在细胞质中,而在自身免疫性疾病和炎症疾病中,MANF表达上调并且由细胞质转移至细胞核内发挥抗炎、抗凋亡作用[10-11]。NF-κB是一种重要的转录调控因子,最常见的是p65和p50异源二聚体结构,在炎症的起始阶段起关键的调控作用[12]。NF-κB蛋白进入细胞核,通过结合到特定的DNA位点(κB位点),激活或抑制靶基因的转录,促进细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α等)以及趋化因子(如IL-8、MIP-1α和MCP-1等)基因表达,影响炎症反应程度和持续时间[13]。本研究结果显示,与Sham组相比,I/R组大鼠缺血侧大脑皮层MANF与NF-κB p65蛋白含量均增加,免疫组织化学也显示I/R组大鼠缺血侧大脑皮质MANF和NF-κB p65免疫阳性细胞数明显增多,表明CIRI促进了脑皮层MANF与NF-κB p65表达的上调,可见抗炎和促炎因素在CIRI时均有所增长。

在正常大鼠的大脑皮层,MANF和NF-κB p65主要表达在细胞质内,本研究中CIRI大鼠脑组织免疫荧光结果显示,大脑皮层中的MANF与NF-κB P65共定位于细胞核,MANF和NF-κB p65出现了核易位,另外,I/R组大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6表达水平也明显增加。有研究[14]发现,在CIRI体外实验中,外源性MANF通过TLR4/MyD88/NF-κB通路抑制炎症反应,恢复老年小鼠CIRI后血脑屏障完整性。也有研究[15]表明,内源性和外源性MANF抑制了兔的关节炎症,具有抗炎作用。因此,推测发生CIRI时,如增加MANF表达和核易位,能与易位到细胞核内的NF-κB p65相互作用,发挥其抗炎作用,减轻CIRI。

内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是内质网内稳态亚细胞损伤的病理过程,也是真核细胞的一种保护性应激反应。诸如缺血再灌注、营养不足、脂质过度负荷、钙浓度变化以及氧化应激等生理病理情况均能诱导内质网内蛋白质的错误折叠,诱发ERS[16]。CHOP是一种应激诱导的核蛋白,通常被用作ERS的标志物[17-18],ERS可以通过上调CHOP启动细胞凋亡[19]。有研究发现,在大鼠帕金森模型中,神经细胞体外过表达MANF后,CHOP表达降低,神经元凋亡减轻,细胞活力提高,表明外源性MANF可以通过抑制ERS对帕金森大鼠黑质纹状体多巴胺能系统有长期的神经保护和神经再生作用[20],促进神经元的存活[21]。也有研究[22]显示,在阿尔兹海默病体外试验中,β淀粉样蛋白(Aβ)处理特异性MANF基因敲除的神经元后,CHOP和cleaved-caspase-3水平明显升高,TUNEL阳性细胞的数量也明显增加,细胞凋亡程度加重,提示内源性MANF在神经元通过抑制ERS起抗凋亡作用。本研究中,I/R组大鼠缺血侧脑组织MANF和CHOP表达增多,TUNEL阳性细胞的数量增加,推测在CIRI中,内源性MANF增加可以部分抵消ERS引发的神经元凋亡,缓解CIRI恶化。

综上,内源性MANF与NF-κB p65及CHOP表达在大鼠体内处于一种动态平衡,在CIRI中,MANF与NF-κB p65在大脑皮层中表达上调并发生核易位,可能在细胞核内相互作用,抑制炎症反应进一步恶化,减轻CIRI。此外,MANF还可能通过抑制ERS,减轻神经元凋亡,从而缓解CIRI。