HPLC法同时测定中消软膏中4种成分含量

毕秋左 安艳苏

【摘 要】目的：建立HPLC法同时测定中消软膏中盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素4种活性成分的含量。方法：采用超声提取法，提取溶剂为甲醇，流动相为乙腈（A）-0.1%的磷酸水溶液（B），检测波长为254 nm，体积流量0.8 mL/min，柱温30 ℃，理论塔板数以盐酸小檗碱计算不低于4000。结果：中消软膏中盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素在线性范围内线性关系良好，平均回收率分别为99.6%、99.8%、99.1%、99.7%，RSD分别为1.0%、0.8%、1.1%、0.3%。结论：该方法简便、快速、精密度和准确度良好，可为中消软膏质量标准提升提供一定依据。

【关键词】中消软膏；盐酸小檗碱；芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素；高效液相色谱

【中图分类号】R286 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）16-0048-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.16.zgmzmjyyzz202316010

Simultaneous Determination of Four Components in Zhongxiao Ointment by HPLC

BI Qiuzuo AN Yansu

Qujing Food and Drug Inspection and Test Center，Qujing 655000，China

Abstract： Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of Berberine hydrochloride、Aloeemodin，Chrysophanol and Imperation in Zhongxiao ointment.Methods miningultrasonic extraction was used，the extraction solvent was methanol，and the mobile phase was acetonitrile （A[BF]）-0.1%[BFQ] phosphoric acid Solution （b），the detection wavelength is 254 nm，the volume flow rate is 0.8mL/min，the column temperature is 30 ℃，The theoretical plate number is not less than 4000 calculated by berberine hydrochloride.Results Berberinehydrochloride，aloe-emodin，chrysophanol and imperatorin have a good linear relationship within the line.The average recoveries were 99.6%，99.8%，99.1% and 99.7% respectivelywith RSD of 1.0%、0.8%、1.1%、0.3% .Conclusion The method is simplerapid with good precision and accuracy，and can provide a basis for the quality standard improvement ofZhongxiao Ointment.

Key words： Zhongxiao Ointment;BerberineHydrochloride;Aloeemodin，Chrysophanol and Imperatorin;High Efficiency Liquid Chromatography

中消軟膏是由大黄、关黄柏、草乌、川乌、制天南星、白芷、白及等十二味药材经粉碎加工制成的制剂。具有清热解毒、散瘀消肿、胜湿止痛的功效。临床上用于热毒瘀滞肌肤所致疮疡中毒，肌肤红、肿、热、痛，关节重着麻木、肿痛、曲伸不利；皮肤疔疮、跌打损伤、风湿痹痛等。方中大黄具有凉血解毒、逐瘀通经，利湿退黄的功效［1-3］。关黄柏为一味常用中药，外用可治疗湿热泻痢、疮疡肿毒、湿疹瘙痒等［4-5］。白芷具有解表散寒、祛风止痛，消毒排脓之功效［6］。该药由昆明市中医医院制备，执行标准为滇ZJGF-557-2020，此标准较简单，未对其中任何成分进行含量控制，查询文献也缺少对该药的相关探索研究。故本文围绕君药大黄、关黄柏中芦荟大黄素、大黄酚、盐酸小檗碱及臣药白芷中欧前胡素活性成分展开研究，采用高效液相色谱法（HPLC法）同时对多成分含量测定，可为中消软膏质量标准提升提供方法参考。

1 材料

1.1 仪器 美国 Agilent 1260型高效液相色谱仪（带二极管阵列检测器）；Mettle MS205DU电子天平（精度为十万分之一）；AS-10200B系列超声波清洗机（60KHz/300W）。

1.2 试剂与药物 芦荟大黄素（中检院，批号：110795-202011）、大黄酚（中检院，批号：110796-201922）、盐酸小檗碱（中检院，批号：110713-202015）、欧前胡素（中检院，批号：110826-201918）。中消软膏（昆明市中医院，批号：21112601、22042901、22022501、22112701）；甲醇、磷酸均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件［6-8］ 依利特SinoChrom ODS-BP色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A[BF]）-0.1%[BFQ]的磷酸水溶液（B）；梯度洗脱，0～19 min，28%A；19～21 min，28%～50%A；21～29 min，50%A；29～34 min，50%～60%A；34～44 min，60%A；44～45 min，60%～28%A；45～50min，28%A。进样量：20 μL；检测波长：254 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：30 ℃。

2.2 混合对照品储备溶液和供试品溶液

2.2.1 鹽酸小檗碱对照储备溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品15.18 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇充分溶解并稀释制成质量浓度为521.5848 μg/mL对照品储备溶液。

2.2.2 大黄酚对照储备溶液制备 精密称取大黄酚对照品10.01 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇充分溶解并稀释制成质量浓度为198.9988 μg/mL对照品储备溶液。

2.2.3 芦荟大黄素、欧前胡素混合对照储备溶液制备 精密称取芦荟大黄素对照品15.26 mg，欧前胡素对照品12.06 mg，分别置于100 mL量瓶中，用甲醇充分溶解并稀释至刻度，摇匀。再分别精密量取上述溶液2.5 mL、5.0 mL，置于同一50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。即得芦荟大黄素7.4392 μg/mL，欧前胡素11.9394 μg/mL的混合对照品储备溶液。

2.2.4 4种成分混合对照溶液制备 分别精密量取“2.2.1”项下储备液2.0 mL，“2.2.2”项下储备液5.0 mL，“2.2.3”项下储备液2.0 mL于同一10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。即得盐酸小檗碱104.3170 μg/mL，大黄酚99.4994 μg/mL，芦荟大黄素1.4878 μg/mL，欧前胡素2.3879 μg/mL的混合对照溶液。

2.2.5 供试品溶液制备［9-10］ 精密称取中消软膏剂（批号为22042901）3 g至50 mL离心管中，加入20 mL甲醇，超声45 min使其溶解，离心，将上清液转移至25 mL量瓶中，洗涤沉淀，合并洗液至25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，备用。

2.2.6 阴性对照溶液制备 按照中消软膏处方工艺制备缺少大黄、关黄柏、白芷的阴性样品，按照2.3项下供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性试验 按“2.1”项下色谱条件，取混合对照溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20 μL进样测定，记录各色谱图。盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素各成分分离度良好，阴性对照溶液在与混合对照溶液相应保留时间处未出现色谱峰，说明中消软膏中其他成分对待测成分无干扰。如图1所示。

2.4 线性考察 分别精密吸取2.2.4项下混合对照溶液1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、10.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度制成标准系列浓度。按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得到各成分的回归方程及线性范围。结果表明各成分对照品在如下线性范围内呈现出良好线性关系。详见表1。

2.5 精密度试验 取2.3项下中消软膏供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测定盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素4个成分的峰面积，计算RSD。结果各成分峰面积的RSD分别为0.18%、1.30%、0.45%、0.88%，可见仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取2.3项下中消软膏供试品溶液，分别于配制后室温下放置0 h、1 h、3 h、9 h、12 h、15 h、18 h、24 h进样，测定峰面积并计算RSD。结果中消软膏中盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素各成分24 h峰面积RSD分别为：0.32%、0.46%、0.55%、0.83%。表明供试品溶液24 h内稳定性较好。

2.6 重复性试验 精密称取中消软膏（批号：22042901）样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，各取20 μL进样测定并记录峰面积，计算得盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素各成分平均含量分别为：244.4040 μg/g、4.5296 μg/g、2.6922 μg/g、7.2705 μg/g；RSD分别为：0.69%、0.57%、1.02%、0.66%，表明方法的重复性良好。

2.7 加样回收试验 精密称取已知含量的样品（批号：22042901）约1.5 g，共6份，分别于样品中精密加入“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”项下对照品储备液0.8 mL、0.2 mL、1.0 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样分析，计算回收率。结果见表2。

2.8 样品含量测定 取4批中消软膏样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果见表3。

3 讨论

医院制剂长期作为一种医院药品的补充形式存在，因制剂制备方法简单方便、使用效果良好的特点在临床用药中占有一定比例。该制剂属于软膏剂，取样时不易操作且易粘附在壁上，查阅软膏剂含量测定方法文献，选择先取用离心管加甲醇适量超声溶解，离心，取上清液至量瓶中的方法，从而解决了粘附问题并且回收率效果良好。

3.1 提取方法及时间选择 先后比较超声和回流两种提取方式提取效果的差别，发现两种提取方式对选定的目标成分的含量无明显影响；再依次考察超声时间30 min、45 min、60 min对提取效率的影响，发现超声30 min时，大黄酚和芦荟大黄素的提取效果不佳；而超声45 min和60 min各主成分提取完全且效果相当；考虑到同等效率用时最短及操作简便易行，故选择超声提取45 min。

3.2 流动相选择 预试验比较了以乙腈-0.1%的磷酸水溶液和以甲醇-0.1%的磷酸水溶液作为流动相的色谱条件优劣，发现乙腈-0.1%的磷酸水溶液系统分离效果更佳，基线平稳，故流动相选择乙腈-0.1%的磷酸。

3.3 检测波长选择 试验中采用二极管阵列检测器对供试品、对照品进行全波长扫描（200～400 nm），发现芦荟大黄素、大黄酚在245 nm处有最大吸收，盐酸小檗碱、欧前胡素分别在345 nm、300nm处有最大吸收，且盐酸小檗碱和欧前胡素在254 nm处也有较大吸收，结合参考文献［5，8］，考虑到各成分色谱峰响应的均匀性，故选择254 nm作为测定波长。

3.4 外用给药 外用给药是中药的传统给药方式，中消软膏作为一种外用中药制剂，使用时和其他外用中药制剂一样具有使用便利、直达病灶等特点。外用药物通常为透皮吸收，而药物经皮吸收率相比较于其他给药方式较差，故准确把握好各个有效成分的量及比例不容忽略［11］。试验中选定盐酸小檗碱、芦荟大黄素、大黄酚、欧前胡素作为指标性成分研究，涵盖了处方中部分君臣药物，通过对各成分含量同时测定，有助于全面控制其质量。

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