烙灸介导Wnt信号通路对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞增殖分化影响

夏铂 范灵

【摘 要】目的：探究烙灸介导 Wnt信号通路对脊髓损伤大鼠内源性神经干细胞增殖分化影响。方法：采用Allen’s法制备脊髓损伤大鼠模型。分为假手术组、模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组，取损伤大鼠脊髓组织。采用运动神经功能评分（CBBB评分）、免疫组化、免疫荧光法检测脊髓组织内源性神经干细胞、神经元细胞及星形胶质细胞的标记物。结果：BBB评分、免疫组化、免疫荧光法检测结果均显示烙灸组最显著，Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义。结论：烙灸激活脊髓损伤大鼠Wnt信号通路，促进其内源性神经干细胞增殖分化为神经元细胞，抑制分化为星形胶质细胞，使其神经细胞修复再生。

【关键词】Wnt信号通路；烙灸；脊髓损伤大鼠；内源性神经干细胞；增殖分化

【中图分类号】R245.82 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2023）16-0011-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.16.zgmzmjyyzz202316004

Effect of LaoMoxibustion Mediated Wnt Signal Pathway on Proliferation and Differentiation of Endogenous Neural Stem Cells in Rats with Spinal Cord Injury

XIA Bo FAN Ling*

Ningxia Medical University，Yingchuan 750004，China

Abstract： Objective To explore the effect of lao moxibustion mediated Wnt signal pathway on the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells in rats with spinal cord injury.Methods Allen’s method was used to prepare the rat model of spinal cord injury.They were were divided into sham operation group，model group，Wnt inhibitor group，lao moxibustion group，lao moxibustion+Wnt inhibitor group.Basso Beattie Bresnahan（BBB） score，immunohistochemistry and immunofluorescence were used to detect the markers of endogenous neural stem cells，neuron cells and astrocytes in spinal cord tissue.Results BBB score，immunohistochemistry and immunofluorescence test results all showed that lao moxibustion group was the most significant，and there was no significant difference between the Wnt inhibitor group and the model group.Conclusion Lao moxibustion activated Wnt signaling pathway in rats with spinal cord injury，promoted the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells into neurons，inhibited the differentiation into astrocytes，and made the repair and regeneration of nerve cells.

Key words： Wnt Signal Path; Lao Moxibustion; Spinal Cord Injury Rat； Endogenous Neural Stem Cells; Proliferation and Differentiation

脊髓损伤作为一种严重创伤性事件，在交通、劳动及运动事故中较为常见，导致中枢神经系统致残损伤。常造成損伤部位以下运动、感觉等功能不可逆转丧失，同时引起肌肉萎缩、压疮、感染，严重导致呼吸障碍［1-2］。脊髓损伤临床手段很多，如手术疗法、大剂量激素冲击疗法、理疗康复等［3］。但损伤后中枢神经细胞完全恢复很难，这些治疗方法只能减少继发性脊髓损伤发生，防止脊髓功能进一步恶化，恢复不了已损伤神经恢复功能。因此，研发一些行之有效治疗促进脊髓损伤处神经细胞修复再生，以恢复脊髓结构及功能是临床急需解决问题。烙灸是脊髓损伤一种新疗法，临床已经取得一定疗效。前期观察烙灸对脊髓损伤大鼠Wnt信号通路作用。发现烙灸能激活Wnt信号通路［4］，而Wnt信号通路能促进多种来源干细胞发生神经分化［5］。此外，Wnt信号通路是调控内源性神经干细胞主要通路［6］。本人提出烙灸激活脊髓损伤大鼠Wnt信号通路，促进其内源性神经干细胞增殖分化为神经元细胞，同时抑制分化为星形胶质细胞，使其神经细胞修复再生。为验证假说，故设计本实验，揭示其机理，为临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性（Sprague Dawley，SD）大鼠50只，SPF级，体质量240～290 g，来自宁夏医科大学实验动物中心。大鼠在安静环境下饲养，给予充足饲养和饮用水，室温20～22 ℃，相对湿度45%，保持动物房内昼夜节律。动物实验严格遵循3R原则。实验方案经宁夏医科大学伦理研究原著委员会批准。

1.1.2 试剂 与仪器巢蛋白抗体（Nestin，DF7754，Affinity），神经胶质纤维酸性蛋白抗体（Glial Fibrillary Acidic Protein，#80788，Cell Signaling Technology），封闭液（浓缩型正常山羊血清，中杉金桥），光学显微镜 （LEICA，德国）、Image-lab图像分析系统和Image-Pro 图像分析系统（BIORADHERCULES，美国）。石蜡切片机（RM2235，Leica公司，德国），全波长酶标仪（Epoch，Biotek公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 脊髓损伤模型 大鼠制备除假手术组外，其他4组大鼠均采用水合氯醛腹腔麻醉，俯臥位固定于大鼠固定器上，椎板咬骨钳咬去T9～T11棘突和椎板，充分露出脊髓组织，避免损伤硬脊膜。运用改良自制Allen’s大鼠脊髓损伤打击装置，使打击棒套入钢管内，通过砝码测量打击棒打击重量达10 g，打击高度5 cm，打击棒自由下落，致使T9～T11节段急性脊髓损伤（不完全性瘫大鼠脊髓损伤模型，属中等程度损伤）。大鼠有摆尾反射，双下肢瘫痪证实造模成功。假手术组只做椎板切除，不损伤脊髓。术后大鼠分笼，饲养于配有空调专用室，注意术后护理防止感染，每日按压膀胱区排尿3次，保持垫料干燥。观察记录大鼠双后肢活动情况、立足伸趾能力、回缩反射、大小便等状态。模型的建立参照《药理实验方法学》［7］及相关文献的方法造模。

1.2.2 实验分组及造模干预 随机将50只SD大鼠分为5组，假手术组：只做椎板切除，不做脊髓损伤。模型组：只造模。Wnt抑制剂组：造模成功后12 h给予Wnt抑制剂腹腔注射给药，每日1次，持续28 d。烙灸组：造模成功后12 h后采用烙灸治疗，烙灸组造模后每日同一时间重复治疗一次，持续28 d。烙灸联合Wnt抑制剂组：造模成功后12 h给予Wnt抑制剂腹腔注射给药，同Wnt抑制剂组，并采用烙灸治疗，同烙灸组，持续28 d。烙灸干预：在损伤大鼠两侧夹脊穴（在距损伤上下端两个椎体棘突间隙旁开距中线3～4 mm处夹脊穴）上，用特制烙灸器，W形薄铁皮制作灸槽，带有手柄，依据损伤脊柱长度制作，放于损伤脊柱上，在灸槽内放入艾绒点燃，艾绒加热传导铁器，铁器传导患处，使局部发热，严格观察皮肤情况，造模后每日1次，每次5 min。

1.2.3 标本采集与处理 干预28 d，将大鼠采用全身灌注多聚甲醛取材，以损伤脊髓为中心取纵向离损伤点长约1 cm脊髓，制成石蜡包块用于免疫组化、免疫荧光检测损伤组织内源性神经干细胞标记物-神经丝巢蛋白（Nestin）、神经元细胞标记物-神经元特异性稀醇化酶（neuron specific enolase，NSE）和星形胶质细胞标记物-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。

1.2.4 脊髓损伤运动功能（basso beattie bresnahan，BBB）评分［8］ 两名不知道实验分组观察者，于造模后第3天、7天、14天、28天运用BBB运动评定量表评估各组大鼠后肢运动情况，评估指标主要包括各个关节活动情况、跨步能力以及其协调性与躯干平衡能力等，0分（无运动功能）至21分（正常运动功能），两人背向评估，平均值是大鼠运动功能最终得分。

1.2.5 免疫组化检测 将石蜡切片脱蜡入水，经二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，利用柠檬酸进行微波修复抗原、内源性过氧化物酶阻断、血清封闭后滴加Nesti（1∶250），GFAP（1∶400），β-Catenin（1∶400）和GSK-3β（1∶400），4℃过夜；第2天，PBS漂洗后加入二抗孵育40 min，PBS漂洗后DAB显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，冲洗返蓝，脱水、透明、中性树胶封固，显微镜下观察并拍片。

1.2.6 免疫荧光检测 切片常规脱蜡至水，将切片置于EDTA抗原修复液，微波炉中高火加热至沸腾，室温冷却5 min后，再中高火加热3 min，再自然冷却至室温。滴加山羊血清封闭液（原液用PBS按1∶9稀释），37℃孵育30 min。甩去多余液体，不洗。实验片滴加适当稀释的一抗，4℃过夜。取出后37℃复温30 min，PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min，3次。滴加DyLight488荧光素标记羊抗兔IgG，37℃ 孵育45 min。PBS（pH 7.2～7.6）洗5 min，3次。滴加DAPI染色液，室温孵育3 min。PBS（pH 7.2～7.6）清洗。抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察结果及拍照。采用ImageJ软件分析各个单位视野内大鼠脊髓组织Nestin、NSE、GFAP阳性细胞数。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行实验数据的统计分析，采用Graphpad Prism 8.0软件进行图的绘制。定量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BBB运动功能评分结果 假手术组大鼠运动功能正常。第3天评分：模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠运动功能评分均小于7分，差异无统计学意义（P>0.05）。第7、14天评分：烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组评分高于模型组、Wnt抑制剂组，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。第21天评分：烙灸组>烙灸联合wnt抑制剂组>模型组>Wnt抑制剂组。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。烙灸联合Wnt抑制剂组较烙灸组评分降低，差异有统计学意义（P<0.05）；第28天评分：烙灸组最高，Wnt抑制剂组最低，差异有统计学意义（P<0.05），Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。见表1，如图1。

2.2 免疫组化检测结果 累积光密度值统计假手术组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值为0。其余4组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值都较假手术组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组与模型组、Wnt抑制剂组相比明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸相比明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中NSE累积光密度值较假手术组显著减少，尤其是模型组、Wnt抑制剂组减少幅度最大，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸组相比降幅明显，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中GFAP累积光密度值较假手术组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组较模型组、Wnt抑制剂组减少，差异有统计学意义（P<0.05）。烙灸联合Wnt抑制剂组较烙灸组高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2，如图2。

2.3 免疫荧光检测结果 免疫荧光检测Nestin、NSE、GFAP阳性细胞数Nestin、NSE、GFAP阳性细胞呈绿色，形态树枝状。Nestin假手术组无阳性细胞。NSE、GFAP假手术组阳性细胞数较多，亮度较亮。其余4组大鼠脊髓组织中Nestin阳性细胞数较假手术组显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组与模型组、Wnt抑制剂组相比明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸组相比明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中NSE阳性细胞数较假手术组显著减少，模型组、Wnt抑制剂组减少幅度最大，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。烙灸联合Wnt抑制剂组与烙灸组相比降幅明显，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组、Wnt抑制剂组、烙灸组及烙灸联合Wnt抑制剂组大鼠脊髓组织中GFAP阳性细胞数较假手术组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。烙灸组、烙灸联合Wnt抑制剂组较模型组、Wnt抑制剂组数值减少，差异有统计学意义（P<0.05）。烙灸联合Wnt抑制剂组较烙灸组高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3，如图3。

3 讨论

3.1 关于烙灸治疗脊髓损伤研究 脊髓损伤是导致截瘫主要原因，全世界平均每年每百万人中有15～40人发生脊髓损伤。给伤者、家庭及社会带来沉重负担，但至今未找到确切、有效治疗方法［9］。研究证实脊髓损伤后神经细胞仍存在一定修复再生能力，而成年哺乳动物脊髓损伤后神经很难修复再生。中医学认为脊髓损伤是督脉损伤，致使气血逆乱，阻滞经络，气血不能温煦濡养肢体导致气血不足，筋脉瘀阻。治宜补气、活血、通络。烙灸是宁夏少数民族医学中一种简单、方便、安全、有效的疗法，也是中医学“化脓灸”发展及延续，其操作比“化脓灸”简便，其透热力强，造成皮肤损伤程度小。而脊髓损伤病机是元阳不足，气滞血瘀，寒凝闭阻经络致使肢体屈伸不利。需要通过强力热效应刺激周围神经敏感度，加强其与大脑中枢神经联系。烙灸具有强力热效应，正有此功效。其能够振奋元阳、温通经脉、化瘀消肿、寒湿祛湿、通经活络而调整人体气机禀性［10］。研究［11］表明，烙灸能够打开药物或热力至皮肤内组织通道，起到消炎、镇痛、增加血液循环、增强机体代谢作用。前期临床观察也证实烙灸治疗脊髓损伤患者能明显提高肌力，促进脊髓损伤患者康复［12］。

3.2 各组大鼠实验结果 分析前期实验研究［4］发现，烙灸可以调节Wnt信号通路，对大鼠脊髓损伤后神经具有修复再生作用。本实验采用BBB运动神经功能评分法、免疫组化、免疫荧光法检测脊髓损伤大鼠脊髓组织内源性神经干细胞标记物（Nestin）、神经元细胞标记物（NSE）、星形胶质细胞标记物（GFAP）。其中BBB评分法是一种定量、客观检测技术，能够对脊髓损伤作出功能性诊断及定量分析。结果显示：BBB运动神经功能评分，烙灸组>烙灸联合Wnt抑制剂组>模型组>Wnt抑制剂组，推断烙灸组、烙灸联合wnt抑制剂组效果明显优于模型组、Wnt抑制剂组，且烙灸组疗效最显著，Wnt抑制剂组与模型组差异无统计学意义（P>0.05）。神经丝巢蛋白（Nestin）是一种细胞骨架蛋白，表达于细胞质中，生存于神经上皮干细胞内，与神经干细胞发育及分化息息相关。其发育期时，Nestin表达逐渐增强，而随着神经干细胞分化结束，Nestin表达也随之下降，Nestin被认为是内源性神经干细胞主要标记物之一，检测Nestin能够鉴定处于分化期内源性神经干细胞［13］。正常脊髓组织内也存在一定量内源性神经干细胞，在非病理情况下，成年动物（神经细胞分化结束）体内内源性神经干细胞处于“静止状态”。研究表明在大鼠出生后6 d脊髓组织中Nestin阳性表达消失。本实验结果证实，假手术组大鼠脊髓组织中Nestin亦累积光密度值及阳性细胞数为0，表明假手术不会引起内源性神经干细胞激活。而大鼠脊髓损伤后Nestin累积光密度值及阳性细胞数显著升高，它主要集中在损伤部位，可见脊髓损伤能够激活内源性神经干细胞，导致内源性神经干细胞向损伤部位迁移。烙灸组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值及阳性细胞数升高趋势与模型组相似，但是烙灸组大鼠脊髓组织中Nestin累积光密度值及阳性细胞数都较模型组有显著升高，可见烙灸能够促进脊髓损伤后损伤局部内源性神经干细胞激活、迁移与增殖。而Wnt抑制剂组与模型组相比，虽无统计学意义，但Wnt抑制剂组值低于模型组，说明Wnt通路被抑制情况下，内源性神经干细胞激活程度明显减低。反过来说明激活Wnt通路，有助于内源性神经干细胞激活。烙灸联合Wnt抑制剂组升高值低于烙灸组，也证实这一点。NSE（神经元特异性稀醇化酶）是神经元细胞特异性标志物，脊髓损伤后大量神经元细胞调亡，如何补充替代缺失神经元细胞是治疗关键。在脊髓组织自我修复过程中，无外界干预情况下，仅少数内源性神经干细胞会分化为神经元细胞［14］。本实验结果也证明，损伤引起脊髓组织中NSE累积光密度值及阳性细胞数下降，模型组大鼠脊髓组织NSE累积光密度值及阳性细胞数急速减少，而其经过烙灸治疗后，损伤局部NSE累积光密度值及阳性细胞数较模型组显著升高，表明烙灸组对损伤局部神经元细胞具有促进其修复及增生功效。而Wnt抑制剂组值低于模型组，说明Wnt通路被抑制情况下，神经元细胞修复及增生能力降低。反过来说明激活Wnt通路，可促进神经元细胞修复及增生。烙灸联合Wnt抑制剂组值低于烙灸组，也证实这一点。GFAP（胶质纤维酸性蛋白）是星形胶质细胞骨架蛋白，和星形胶质细胞运动及形状调节密切相关，其是星形胶质细胞特异性标记物。发育期时，星形胶质细胞可诱导神经元突起定向生长。成年动物体内星形胶质细胞又具有支持、营养、隔离及保护神经元细胞作用。然而，当中枢神经系统损伤后，星形胶质细胞反应性增生，其过度增生会形成胶质瘢痕，同时分泌抑制性分子，影响神经细胞修复再生［15］。结果显示，脊髓损伤后局部GFAP累积光密度值及阳性细胞数就显著增多。而烙灸组GFAP累积光密度值及阳性细胞数损伤后也有增加，但其表达都较模型组显著减少。据此可知，烙灸可能抑制脊髓损伤后损伤局部星形胶质细胞过度增生，减少瘢痕组织的形成，从而促进轴突再生。而且相关研究［16］已证实，降低GFAP累积光密度值及阳性细胞数能减少胶质瘢痕形成，使軸突得以生长及修复，降低对神经细胞损害，从而促进脊髓损伤大鼠肢体运动功能恢复。而Wnt抑制剂组值高于模型组，说明Wnt通路被抑制情况下，减少胶质瘢痕形成能力减弱。反过来说明激活Wnt通路，可减少胶质瘢痕形成。烙灸联合Wnt抑制剂组值高于烙灸组，也证实这一点。

综上所述，烙灸有利于脊髓损伤大鼠神经功能恢复，通过激活脊髓损伤大鼠Wnt信号通路，促进其内源性神经干细胞增殖分化为神经元细胞，同时抑制分化为星形胶质细胞，使其神经细胞修复再生。

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