时间与功率对BL21大肠杆菌超声破碎效果的影响

鄢树枫,王钰坪,吴珊涛,王晓媛,戴心如

(三明学院 资源与化工学院,福建 三明365004)

大肠杆菌(Escherichiacoli)是一种原核生物,革兰氏染色反应呈红色,在自然界中分布广泛,主要寄居在人和动物的肠道等部位[1-2]。大肠杆菌由于其结构简单、遗传背景清楚、表达效率高、易培养、分子操作简单和副产物表达量少等特性,常作为科研生产中原核表达宿主菌,广泛应用于生物学研究中,因而受到众多研究者的亲睐[3-5]。

胞内蛋白质提取纯化首先要对大肠杆菌进行高效破碎。大肠杆菌的破碎方法主要可分为机械法和非机械法,常见的机械法主要包括匀浆法、研磨法和超声波破碎法等,非机械法主要有渗透法、酶溶法和冻溶法等,各种破碎方法均有其最佳适用范围及其优缺点[6]。超声破碎法破碎细胞具有速度快、操作方法简单等优点,更适合于实验室使用,短时间即可完成一个样品处理,成本低廉[7]。超声波在液体中的空化效应会形成空化泡,空化泡不断扩大或突然崩解,使细胞壁裂开或破碎,以达到破碎细胞的目的。梁蕊芳[8]等通过研究不同菌种浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌在不同超声功率、超声时间下的细胞破碎效果,证明超声破碎对几种常见菌体均有良好的破碎效果。值得注意的是,使用超声破碎细胞的影响因素较多,尤其是超声破碎可能会对可溶性蛋白和包涵体的得率造成影响,这是由于在超声破碎过程中超声波的作用较为剧烈,可能会对蛋白质的结构和活性等方面造成影响[9]。赵烨清等[10]在研究中发现,超声破碎法可能使可溶性蛋白质发生变性沉淀,这使得后续的蛋白质分离纯化更加复杂,需要额外的复性环节。余雁等[11]研究了超声波破碎方法中各种物理参数及其对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌破碎的影响,证明超声破碎的系列参数对破碎效果具有显著的影响作用。彭赞国等[12]以超声、高压匀浆和化学渗透法破碎重组大肠杆菌,研究了超声功率、菌体体积、菌体浓度对超声破碎的影响,证明超声破碎受到多种因素的调控,这些因素对超声破碎的效果具有直接的调控作用。菌体破碎是目标蛋白分离纯化的首要步骤,超声破碎产生的局部高温可能使破碎后释放的蛋白质变性,对后续的蛋白质提取和纯化环节有显著影响[13]。

BL21(DE3)是大肠杆菌表达菌株,以T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主,已广泛应用于各类蛋白表达,其破碎效果的优劣能够显著影响后续蛋白质的表达纯化效果[14]。然而,当前BL21大肠杆菌的超声破碎影响因素研究不足,尤其是BL21大肠杆菌的超声破碎效果与功率的相关性研究有待深入。因此,研究不同功率对BL21大肠杆菌超声破碎的效果,探究其最佳的破碎功率和时间,对于蛋白质的表达纯化具有重要意义。本研究以BL21大肠杆菌为实验宿主菌,研究不同功率对其超声破碎的效果,设置不同时间和功率梯度对大肠杆菌BL21进行超声破碎,并获取其胞内蛋白质,通过蛋白质浓度检测及考马斯亮蓝(Bradford法)测定蛋白质含量,进而评价大肠杆菌BL21的超声破碎效果,以期为大肠杆菌超声破碎的研究和应用提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

实验相关化学试剂胰蛋白胨、氯化钠、酵母提取物、Tris-HCl、甘油、考马斯亮蓝G-250、乙醇等主要购买于阿尔法化工有限公司、西格玛奥德里公司和上海碧云天生物科技有限公司。大肠杆菌BL21(DE3)菌种由中国科学院福建物质结构研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 菌种活化、复苏及其生长曲线测定

将从- 80℃冰箱中取出的菌种转移进超净工作台中,将其在含有3 mL液体培养基的试管中进行接种,采用封口膜封口,放置于恒温摇床震荡培养,同时试管要保持倾斜,温度为37℃,转速为220 rpm,过夜培养16～18 h。隔天对菌种进行分装冻存,并取适量菌用于生长曲线的测定。

取2.5 mL已复苏菌液,将其在含有100 mL LB(Luria-Bertani)液体培养基的锥形瓶中进行接种,混合均匀后,放置于恒温摇床振荡培养,温度为37℃,转速为220 r/min。取一空白的培养基3 mL置于比色皿中,作为分光光度计空白对照。设定合理间隔时间,分别取2 mL菌液测600 nm处的吸光度值(OD600nm),记录数据,测满24 h。根据所得数据,绘制BL21菌株生长曲线。

1.2.2 菌体收集

如上述方法接种适量菌液(100 mL),于OD600nm达到0.6时,加入0.1 mmol/L诱导剂异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导胞内蛋白质表达,于摇床中持续培养18 h。将完成过夜培养的菌种倒入离心管中进行收菌,于离心机中以5 000 r/min转速离心5 min,使菌体和培养液分离。离心完成后用移液枪吸弃上清液,保留沉淀,将沉淀置于冰上保存,维持胞内蛋白质稳定性。

1.2.3 超声破碎

将上述获得的菌体沉淀用30 mL预冷的裂解缓冲液重悬,得到的菌液浓度经计算为3.772×109cfu/mL(OD600nm=1.886)。重悬时注意要充分将菌体重悬,避免因菌块存在导致后续破碎效果下降。重悬后将溶液转移至50 mL离心管中,置于超声破碎仪中进行破碎。为避免在超声破碎过程中蛋白质因局部高温变性,将待破碎的菌液管放置于装有冰块的烧杯中。设置破碎模式为破碎1 s,间隔1 s。每次破碎后的菌液均取1 mL装入EP(eppendorf)管中待测。设计实验组,分别以破碎时间和破碎功率为变量研究大肠杆菌BL21的超声破碎效果,实验组如表1。

表1 BL21超声破碎实验组

1.2.4 蛋白质浓度检测(蛋白质浓度仪检测法与考马斯亮蓝染色法)

将超声破碎完成后得到的各实验组EP管菌液放置于高速离心机中,以12 000 r/min转速离心10 min,使蛋白上清液与细胞碎片分离。离心后,将上清液转移至另一新EP管中保留,弃去沉淀。

蛋白质浓度仪检测法。使用核酸蛋白检测仪对各组上清液样品进行蛋白质浓度检测,测试三次计算平均值,记录数据。

考马斯亮蓝染色法。从前述获得的蛋白质上清液中取15 μL加入至准备好的500 μL考马斯亮蓝G-250工作液,混匀,观察颜色及其与对照管的区别。分别从各组染色混合液取1 mL,加入2 mL蒸馏水稀释,充分混合,并测量其于595 nm处的吸光度值(考马斯亮蓝染色后的特征吸收峰,OD595nm),测试3次,计算平均值,记录数据。对照组以515 μL考马斯亮蓝G-250工作液和2 mL蒸馏水混合,作为分光光度计的参比溶液。

2 实验结果与分析

2.1 大肠杆菌生长曲线

取适量大肠杆菌BL21进行生长曲线测定,不同时间点测量菌液的OD600nm值,记录数据,绘制BL21菌株的生长曲线。由图1可知,接种后,0～2 h是大肠杆菌BL21的生长延滞期(复苏期),该阶段菌体增殖分裂较为缓慢,正在适应新环境并复苏其状态;3～10 h是大肠杆菌BL21的对数生长期,该阶段菌体增长迅速,呈“对数”型增长,此时菌体在快速增殖分裂,菌活力也在快速提高;11 h左右后,菌数量与菌活力接近达到最大值;继续培养后,受限于培养基消耗、菌瓶容量等生长环境因素,其生长进入平稳期,逐步减慢增殖分裂速度。以上实验符合标准化大肠杆菌的生长曲线,证明实验所用大肠杆菌BL21能够维持较好的生长态势,满足后续蛋白质表达及实验要求。

图1 大肠杆菌BL21的生长曲线

2.2 BL21超声破碎实验组1的结果

根据实验组1设定,探究大肠杆菌BL21在破碎功率5%、递增时间为1 min时的破碎效果。由图2可知,上清液蛋白质浓度和大肠杆菌BL21的破碎时间呈近似线性关系(正相关)。上清液蛋白质浓度随破碎时间增加而增加。图3的实验组1破碎上清液的蛋白质的考马斯亮蓝染色结果与蛋白质浓度的测定结果相吻合,其蓝色程度随破碎时间增加而逐渐加深,证明上清液中蛋白质含量亦逐渐提高。

图2 实验组1中破碎上清液的蛋白质浓度

图3 实验组1中破碎上清液的蛋白质的 考马斯亮蓝染色

2.3 BL21超声破碎实验组2的结果

根据实验组2的设定,探究大肠杆菌BL21在破碎功率5%、递增时间为3 min时的破碎效果。由图4可知,上清液蛋白质浓度和大肠杆菌BL21的破碎时间呈近似线性关系(正相关),上清液中蛋白质浓度随破碎时间增加而逐步递增。由图5可知,实验组2破碎上清液的蛋白质经考马斯亮蓝染色后在595 nm处的吸光度值(OD595nm)随破碎时间而增加。这个结果表明,随破碎时间增加,上清液中考马斯亮蓝染色程度更深,上清液中蛋白质含量亦逐渐提高。

图4 实验组2中破碎上清液的蛋白质浓度

图5 实验组2中破碎上清液经考马斯亮蓝染色后在595nm处的吸光度值(OD595nm)

2.4 BL21超声破碎实验组3的结果

根据实验组3的设定,探究大肠杆菌BL21在破碎功率5%、递增时间为5 min时的破碎效果。由表2可知,破碎功率为5%时,随破碎时间增加,上清液蛋白质浓度也增加,蛋白质浓度和破碎时间呈正相关。并且在前20 min破碎时蛋白质浓度上升趋势较大。20 min后蛋白质浓度的上升趋势减缓,可能原因为此时菌体已大部分破碎完成,待破碎的菌量较少。经考马斯亮蓝染色后在595 nm处的吸光度值(OD595nm)的变化趋势与蛋白质浓度结果相一致,在5～15 min阶段上升明显,15～30 min出现波动。该结果与前述的实验组1和实验组2的结果相吻合,进一步证明大肠杆菌BL21的破碎效果即上清液蛋白质浓度与破碎时间呈正相关。

表2 实验组3中破碎上清液的蛋白质浓度及OD595nm

2.5 BL21超声破碎实验组4的结果

根据实验组4的设定,探究大肠杆菌BL21分别在破碎功率1%、3%和9%时的破碎效果(固定1 min破碎时间),结果如表2,图4所示。

结合表3、图6～7可知,固定1 min破碎时间时,大肠杆菌BL21的破碎效果与破碎功率呈正相关关系,功率为1%时,蛋白质浓度为509.4 μg/mL;功率为3%时,蛋白质浓度为576.8 μg/mL;功率为9%时,蛋白质浓度为641.8 ug/ml,呈现逐步上升趋势。各组别经考马斯亮蓝染色后在595nm处的吸光度值(OD595nm)的变化趋势与蛋白质浓度的结果相一致,随破碎功率的递增(1%,3%,9%),考马斯亮蓝染色后的OD595 nm值亦逐步递增,表明破碎功率的提升有助于获得更多的上清液蛋白,该结果与前述的实验组1、2和3的结果相吻合,证明大肠杆菌BL21的破碎效果与破碎时间、破碎功率呈正相关。

图6 实验组4中破碎上清液的蛋白质浓度

图7 实验组4中破碎上清液经考马斯亮蓝染色后在595nm处的吸光度值(OD595nm)

表3 实验组4中破碎上清液的蛋白质浓度及OD595nm

3 结论

本文以BL21大肠杆菌为实验宿主菌,研究不同时间和功率梯度对其超声破碎效果的影响。研究结果表明,超声功率对大肠杆菌BL21破碎效果有明显影响,破碎功率固定为5%时,破碎效果与破碎时间呈正比,菌充足的情况下,破碎时间越长其破碎效果越好;当破碎时间固定为1 min时,破碎功率从1%、3%和9%逐级递增时,其超声破碎效果亦逐渐提升,证明破碎效果与破碎功率呈线性关系。