房水与角膜样本对疱疹病毒阳性角膜移植后不同层次病毒DNA检测效率比较

臧云晓 彭荣梅 肖格格 何林辉 洪晶

北京大学第三医院眼科 眼部神经损伤的重建保护与康复北京市重点实验室,北京 100191

目前已知感染角膜组织的病毒多为疱疹病毒,包括1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)、巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)和EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV),上述疱疹病毒可以分布于角膜任何层次,造成不同层次的角膜感染[1]。在既往研究中,HSV-1相关的角膜感染多见于角膜上皮层和基质层。有研究显示,在357例新发HSV角膜炎中,角膜上皮炎和基质炎分别占66%和30%[2]。HSV角膜内皮炎未见流行病学报道;VZV可以感染角膜各个层次,但常见于角膜基质炎和内皮炎[3-4];CMV主要造成角膜内皮炎[5],在亚洲人群中常见,日本一项研究显示,在29例病因未明的角膜内皮炎中,CMV DNA阳性率为24%[6]。CMV角膜上皮炎和基质炎仅有少量病例报道[7-8];目前对EBV角膜感染知之甚少,仅在干燥性角结膜炎患者的泪液、角膜基质炎和角膜内皮炎的房水中检测到EBV DNA存在[5,9-10]。本课题组前期研究显示,在连续收集的44例病毒性角膜内皮炎患者中,CMV、HSV、VZV和EBV的占比分别为45%(20/44)、18%(8/44)、23%(10/44)和14%(6/44)[4]。当前,疱疹病毒性角膜炎的诊断主要依据临床症状和体征,例如HSV角膜上皮炎在特殊时期存在典型的树枝状或地图状角膜上皮缺损;VZV角膜基质炎表现为对应部位的基质混浊,通常发生在皮疹痊愈后;大多数CMV角膜内皮炎可见钱币状角膜后沉着物、局限性角膜水肿以及轻度前葡萄膜炎[11]。然而,一些不被人们熟知的疱疹病毒性角膜炎,如HSV角膜内皮炎、CMV角膜基质炎等往往无法通过临床特征诊断。实时荧光定量PCR是近年来广泛应用于眼部疱疹病毒感染的一种检测方法,该方法可以帮助诊断之前无法确诊病原体的病毒性角膜炎[12-13]。病毒DNA PCR检测可以帮助确定疱疹病毒种类[14],从而明确诊断和调整用药。在疱疹病毒角膜炎的病毒DNA检测中,角膜和房水是2种常用的取材检测样本,在角膜移植患者中非常容易获取[13]。然而,对于非角膜移植患者,角膜通常难以获取,房水也需要进行前房穿刺才能获得,因其为有创操作,增加了眼部感染和出血的风险,很多患者不愿接受,因此经验性诊治仍然是目前的临床现状。然而,经验性治疗使得在抗病毒药物的选择上存在困难,往往贻误最佳治疗时机。本研究选取疱疹病毒DNA阳性的角膜移植患者,通过分析疱疹病毒DNA在角膜层次中的分布,比较角膜和房水样本在该人群中的病毒DNA检测效率,旨在提高临床疱疹病毒DNA的检出率,明确疱疹病毒性角膜炎的分类诊断,尽早开展合理治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用诊断试验研究方法,收集2015年5月至2021年8月在北京大学第三医院眼科行角膜移植手术且术中行房水和/或角膜组织病毒学检测的患者资料。纳入患者至少有1种样本病毒检测结果阳性。病毒检测包括CMV、VZV、HSV-1、HSV-2和EBV。纳入标准:(1)既往或目前存在角膜炎症反应;(2)存在相应部位角膜病变;(3)符合不同疱疹病毒角膜感染的临床症状和体征;(4)房水和/或角膜组织的病毒检测阳性。排除标准:(1)2种或2种以上疱疹病毒阳性的患者;(2)由于临床证据不足无法判断角膜病变层次的患者。本研究遵循《赫尔辛基宣言》,研究方案经北京大学第三医院医学伦理委员会批准(批文号:M2021283),入组患者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1资料收集和分析指标 通过北京大学第三医院临床病历系统收集疱疹病毒DNA阳性患者的一般资料,包括性别、年龄、疱疹病毒类别和病变层次。分析疱疹病毒DNA在角膜的分布层次和比例。样本检测种类包括角膜和房水。病变层次依据手术方式和辅助检查结果进行判断。病变层次分为角膜内皮层和基质层。因角膜基质病变行前部板层角膜移植术(anterior lamellar keratoplasty,ALK)或穿透角膜移植术(penetrating keratoplasty,PKP)而术中观察内皮层正常者视为基质层病变,因角膜水肿无基质浸润和瘢痕而行角膜内皮移植术(Descemet stripping automated endothelial keratoplasty,DSAEK)的患者视为内皮层病变。

通过北京大学第三医院临床医嘱系统收集同时存在角膜和房水双样本病毒DNA检测结果患者的临床和样本资料,分析不同种类疱疹病毒在角膜和房水中病毒DNA检测的样本数和比率,通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)的曲线下面积(area under curve,AUC)评估不同疱疹病毒在角膜和房水中的病毒检测效率,即灵敏度。

1.2.2样本收集 角膜移植手术操作均由同一经验丰富的眼科医生完成,手术方式分为PKP、ALK和DSAEK。在角膜移植术中采集角膜和房水样本。在钻取角膜组织前,用1 ml注射器行前房穿刺抽取足量房水,然后处理患者病变角膜组织。术中刮除患者角膜上皮组织,取下的病变角膜若为板层组织,撕除角膜前部板层,留取角膜后部基质层送检;若为全层角膜,则分别撕取角膜内皮层和基质层,并分别送检;若为内皮层则直接送检。

1.2.3PCR法检测病毒种类 取出的房水和角膜分别放入1.5 ml EP管中,送至北京大学第三医院眼科临床检验中心进行检测。根据产品说明,使用QIAamp DNA微量试剂盒(德国Qiagen公司),从获取的角膜或房水中提取DNA。将检测样品置于1.5 ml离心管中并用加有蛋白酶K的缓冲液ATL消化。将提取到的DNA在DEPC水(上海碧云天生物技术公司)中稀释;DNA均定量50 ng进行PCR。按照说明,使用荧光定量PCR仪(美国PE Biosystems公司),通过基于TaqMan探针荧光定量PCR的方法(HSV-1、HSV-2 RT-PCR试剂盒,Z-SD-0136-02;VZV RT-PCR试剂盒,OD-0024-02;CMV RT-PCR试剂盒,Z-OD-002-02;EBV RT-PCR试剂盒,Z-OD-0023-02;上海之江生物科技股份有限公司)进行检测。病毒DNA的检测限度为每个样品大小10个拷贝。每个样品均添加内部对照以评估分离和扩增功效。试剂盒制造商提供阳性、阴性和内部对照。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 疱疹病毒DNA阳性的病毒种类

共纳入角膜移植术中疱疹病毒DNA阳性患者166例166眼,其中CMV DNA检出率最高,阳性75眼(占45.2%),男34眼,女41眼,平均年龄(40±29)岁;其次为HSV-1 DNA,阳性34眼(占20.5%),男27眼,女7眼,平均年龄(59±21)岁;第3位为VZV DNA,阳性30眼(占18.1%),男17眼,女13眼,平均年龄(45±26)岁;第4位为EBV DNA,阳性27眼(占16.3%),男12眼,女15眼,平均年龄(46±29)岁;未检测到HSV-2阳性者。

2.2 疱疹病毒DNA在角膜的层次分布比较

CMV和VZV DNA在角膜内皮层分布者分别为47眼(占62.7%)和26眼(占86.7%),明显多于基质层的28眼(占37.3%)和4眼(占13.3%),差异均有统计学意义(χ2=4.813、16.133,均P<0.05)。HSV-1和EBV DNA在角膜内皮层分布者分别为8眼(占23.5%)和5眼(占18.5%),分别少于基质层的26眼(占76.5%)和22眼(占81.5%),差异均有统计学意义(χ2=9.529、10.704,均P<0.001)(表1)。

表1 疱疹病毒DNA在角膜的检出层次分布比较[眼数(%)]Table 1 Comparison of layer distribution of herpesvirus DNA detection in cornea [eyes (%)]病变层次总眼数CMV DNA阳性VZV DNA阳性HSV-1 DNA阳性EBV DNA阳性基质层8028(37.3)4(13.3)26(76.5)22(81.5)内皮层8647(62.7)26(86.7)8(23.5)5(18.5)χ2值4.81316.1339.52910.704P值<0.05<0.001<0.001<0.001 注:(χ2检验) CMV:巨细胞病毒;VZV:水痘-带状疱疹病毒:HSV:单纯疱疹病毒;EBV:EB病毒 Note:(χ2test) CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Ep-stein-Barr virus

2.3 疱疹病毒DNA在角膜和房水样本中的检测效率

在疱疹病毒DNA阳性患者的166眼中,具有房水和角膜双样本病毒检测结果者73眼,其中CMV、VZV、HSV-1、EBV DNA阳性的样本数分别为28、14、18和13眼。在73眼146例检测样本中,CMV、VZV、EBV角膜阳性房水阴性、房水阳性角膜阴性、角膜和房水均阳性占比总体比较差异均有统计学意义(χ2=5.143、6.143、11.231,均P<0.05)(表2)。疱疹病毒DNA阳性样本的检测灵敏度结果显示,角膜样本的病毒PCR检测总体灵敏度为71.6%,高于房水的54.1%,其中,CMV和VZV DNA阳性的角膜样本检测灵敏度分别为64.3%(AUC=0.821,95%CI:0.705～0.938)和35.7%(AUC=0.679,95%CI:0.475～0.882),分别低于房水样本的71.4%(AUC=0.875,95%CI:0.750～0.964)和85.7%(AUC=0.929,95%CI:0.816～1.000)。HSV-1和EBV DNA阳性的角膜样本检测灵敏度分别为100%(AUC=1.000,95%CI:1.000～1.000)和92.3%(AUC=0.962,95%CI:0.875～1.000),明显高于房水样本的27.8%(AUC=0.639,95%CI:0.455～0.823)和23.1%(AUC=0.615,95%CI:0.395～0.835)(表3,图1)。

表2 疱疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒检测结果比较[眼数(%)]Table 2 Comparison of herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples [eyes (%)]类别总眼数CMV DNA阳性VZV DNA阳性HSV-1 DNA阳性EBV DNA阳性角膜阳性房水阴性33(44.6)8(28.6)2(14.3)13(72.2)10(77.0)房水阳性角膜阴性20(27.0)10(35.7)9(64.3)0(0.0)1(7.7)角膜和房水均阳性20(27.0)10(35.7)3(21.4)5(27.8)2(15.4)χ2值4.2435.1436.1433.55911.231P值0.1200.0230.0460.0590.004 注:(χ2检验) CMV:巨细胞病毒;VZV:水痘-带状疱疹病毒:HSV:单纯疱疹病毒;EBV:EB病毒 Note:(χ2 test) CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Ep-stein-Barr virus

表3 疱疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒检测效率[例数(%)]Table 3 Efficiency of herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples [cases (%)]样本类别总例数CMV DNA阳性VZV DNA阳性HSV-1 DNA阳性EBV DNA阳性角膜组织PCR阳性53(36.3)18(32.1)5(17.9)18(50.0)12(46.1)角膜组织PCR阴性20(13.7)10(17.9)9(32.1)0(0.0)1(3.8)AUC0.8580.8210.6791.0000.96295% CI0.793-0.9230.705-0.9380.475-0.8821.000-1.0000.875-1.000灵敏度71.6%64.3%35.7%100%92.3%房水样本PCR阳性40(27.4)20(35.7)12(42.9)5(13.9)3(11.5)房水样本PCR阴性33(22.6)8(14.3)2(7.1)13(36.1)10(38.5)AUC0.7700.8750.9290.6390.61595% CI0.692-0.8490.750-0.9640.816-1.0000.455-0.8230.395-0.835灵敏度54.1%71.4%85.7%27.8%23.1% 注:CMV:巨细胞病毒;VZV:水痘-带状疱疹病毒;HSV:单纯疱疹病毒;EBV:EB病毒;AUC:曲线下面积;CI:置信区间 Note:CMV:cytomegalovirus;VZV:varicella-zoster virus;HSV:herpes simplex virus;EBV:Epstein-Barr vi-rus;AUC:area under curve;CI:confidence interval

图1 疱疹病毒DNA在角膜和房水中的病毒检测ROC曲线 A:病毒检测ROC曲线 角膜样本AUC=0.858,房水样本AUC=0.770 B:CMV检测ROC曲线 角膜样本AUC=0.821,房水样本AUC=0.875 C:VZV检测ROC曲线 角膜样本AUC=0.679,房水样本AUC=0.929 D:HSV-1检测ROC曲线 角膜样本AUC=1.000,房水样本AUC=0.639 E:EBV检测ROC曲线 角膜样本AUC=0.962,房水样本AUC=0.615Figure 1 ROC curves for herpesvirus DNA detection in corneal and aqueous humor samples A:ROC curves for overall viral detection AUC for corneal samples was 0.858,and for aqueous humor samples was 0.770 B:ROC curves for CMV detection AUC for corneal samples was 0.821,and for aqueous humor samples was 0.875 C:ROC curves for VZV detection AUC for corneal samples was 0.679,and for aqueous humor samples was 0.929 D:ROC curves for HSV-1 detection AUC for corneal samples was 1.000,and for aqueous humor samples was 0.639 E:ROC curves for EBV detection AUC for corneal samples was 0.962,and for aqueous humor samples was 0.615

3 讨论

针对不同种类的疱疹病毒,抗病毒药物选择存在差异。美国HEDS(The Herpetic Eye Disease Studies)提出,阿昔洛韦对HSV/VZV感染治疗效果较好,之后发现伐昔洛韦、泛昔洛韦作为其前体药物更为有效,且给药方式更为简单[15]。更昔洛韦是治疗CMV感染的一线用药[16],在更昔洛韦出现耐药后,可选择性使用膦甲酸作为二线用药。眼部样本病毒DNA检测是目前明确诊断疱疹病毒种类的最有效方法,但病毒DNA检测结果假阴性率较高,一些患者往往需要多次送检才能得到阳性结果[17]。研究不同眼部样本病毒DNA的检测效率有助于尽早明确疱疹病毒种类,及时开展治疗。

本研究排除了同一个体多种疱疹病毒DNA阳性的患者,避免了同一个体不同疱疹病毒在角膜分布层次上造成的混杂。本组疱疹病毒阳性的角膜移植患者中,CMV DNA的检出率最高,与欧美等国家的报道有所区别。CMV在亚裔人群中检出率较高,尤其在内皮病变患者中发生率更高[18]。在角膜内皮层的疱疹病毒DNA分布中,CMV和VZV DNA分别位于第1位和第2位,因此应引起眼科医生警觉。

本研究发现,疱疹病毒在角膜和房水样本中病毒DNA检测效率可能与疱疹病毒DNA的角膜分布层次和潜伏位点有关。CMV和VZV DNA多分布于角膜内皮层,在病毒DNA检测中,房水的检出率和检测效率均高于角膜。这可能是由于病毒在角膜内皮细胞内不断复制,裂解细胞释放病毒,从而引起房水中病毒滴度升高[18];而角膜内皮层在移植术前往往仅残留极少量内皮细胞,因此病毒滴度低于其在房水中的滴度。研究认为CMV角膜炎可能来自体内疱疹病毒的再激活,CMV透过血-房水屏障到达前房,感染角膜内皮细胞、小梁网内皮细胞等,进而引发广泛的眼前节炎症反应[19-22]。HSV-1和EBV的角膜感染多发生于基质层,在病毒DNA检测中,角膜的检出率和检测效率高于房水。这可能是由于HSV-1复制产生的病毒难以突破后弹力层及内皮层进入房水,从而积聚在角膜中造成的。研究显示,HSV-1和EBV在角膜、房水、泪液中均可检测到[5,23],但未见各种样本检出率的比较研究。对于HSV-1角膜感染,动物实验认为其来自于潜伏神经节细胞的病毒再激活,沿神经轴突逆行引起角膜上皮炎或基质炎[24],这与本研究中HSV-1 DNA角膜分布层次的研究结果相一致。

本研究探讨了疱疹病毒阳性的角膜移植患者这一特定人群中疱疹病毒DNA在角膜组织中的分布,属于抽样调查,在一定程度上反映了人群中疱疹病毒阳性患者在角膜组织间的分布特点,为今后的相关研究提供了参考。

总之,本研究结果显示在疱疹病毒阳性的角膜移植患者中,CMV DNA的检出率最高,CMV和VZV DNA多在角膜内皮层被检出,HSV-1和EBV DNA多在角膜基质层被检出。在针对角膜和房水对疱疹病毒角膜感染检测效率的评估中,对疱疹病毒整体而言,角膜的病毒检测灵敏度高于房水;对于具体的疱疹病毒而言,CMV和VZV房水检测敏感性高于角膜组织,HSV-1和EBV角膜检测敏感性高于房水。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明臧云晓:直接参与选题、酝酿和设计试验、实施研究、采集数据、分析/解释数据、起草及修改文章;彭荣梅:设计试验、分析/解释数据,对文章内容审阅和修改;肖格格:采集数据、起草文章、对文章内容审阅和修改;何林辉:设计试验、实施研究、采集数据、起草文章;洪晶:采集数据、对文章内容审阅和修改及定稿