猪伪狂犬病毒快速检测方法研究进展

张众，王新茹，殷健，陈彤，庄林林，申秋平*

（ 1.沛县畜牧兽医站，江苏 徐州 221600 ； 2.江苏农林职业技术学院，江苏 镇江 212400 ； 3.国药集团扬州威克生物工程有限公司，江苏 扬州 225127 ）

伪狂犬病是由伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的一种急性、接触性传染病[1-2]。PRV感染会导致猪的生长及繁殖指标严重下降，给我国养猪业造成了一定经济损失。我国将猪伪狂犬病列入需要进行净化的疫病的行列，并通过PRV糖蛋白基因（gE）缺失疫苗有效遏制了疫情蔓延。但近年来有研究发现，PRV野毒株已发生新变异（PRV Ⅱ型）且毒力强于经典毒株（PRV Ⅰ型），现有的疫苗难以提供有效保护。目前，国内外临床中均有人感染PRV的案例，主要表现为视网膜炎或眼内炎，严重者可表现为急性脑炎，甚至发展为神经系统症状[3]。因此，精准检测PRV对有效防控潜在的PRV感染风险具有重要意义。本文就当前国内外已发表的PRV快速检测方法进行综述，以期为我国猪伪狂犬病净化以及科学防控潜在的PRV感染风险提供参考。

1 基于免疫学的检测方法

1.1 酶联免疫吸附试验检测方法

酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原或抗体固定到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性反应进行定性或定量检测的方法。袁梦等[4]通过表达PRV FA株糖蛋白gE制备单克隆抗体，开发了一种特异性的竞争ELISA抗体检测试剂盒，结果表明，该试剂盒效价可达1∶5 120。郭忠欣等[5]以PRV流行株gE重组蛋白为包被抗原，建立了一种可快速检测PRV野毒株抗体的间接ELISA方法。经试验验证，间接ELISA方法与PRV疫苗免疫血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV2）等无交叉反应性，且检测结果与商品化gE-ELISA试剂盒具有较高的一致性。寇晓晶等[6]基于PRV gE蛋白建立的ELISA抗体检测方法与商业化试剂盒总体符合率达89.84%，并具有良好的可重复性。刘旻翾等[7]以PRV gB蛋白为包被抗原，建立了一种间接ELISA抗体检测方法。研究表明，该方法检测限为血清稀释度1∶128，且具有良好的特异性，与口蹄疫病毒、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）等阳性血清无交叉反应。

为简化采样步骤，Cheng等[8]利用ELISA方法评估了直接从猪口腔液中检测PRV抗体的效果。结果显示，基于口腔液检测的IgG ELISA表现出良好的诊断性能（ROC曲线下面积为93%）和可重复性（R2=99.3%）。研究表明，猪口腔液有望作为可选采样方案用于PRV的快速检测。

1.2 免疫层析技术检测方法

免疫层析技术是一种简单、快速、成本可控的检测方法，能够利用特异性的抗原-抗体反应对靶标进行快速识别，适用于栏边检测[9]。王华俊等[10]利用胶体金标记纯化的抗PRV gB单克隆抗体制备出一种可用于PRV即时检测的胶体金试纸条。经测试，该试纸条具有较低的检测限，且与PRRSV、PPV等无交叉反应性。陈辉[11]使用铕纳米颗粒标记PRV病毒颗粒和羊抗鸡IgY制备出荧光探针，开发出一种快速灵敏的PRV gE抗体阻断荧光免疫层析试纸条。经测试，该方法与其他猪病病毒感染血清的交叉反应率低，批内和批间变异系数均小于15%，且具有较长的保存期限，为PRV现场快速检测提供了新的有力支持。

1.3 荧光微球免疫检测方法

微纳米磁珠具有表面积大、易制备和储存、表面可进行多种修饰、超顺磁性等优点。在免疫学检测中，微纳米磁珠可以快速分离、富集、纯化和检测靶分子，特别是对存在于复杂的生物体系中，且具有浓度低、难以检测特点的分子来说更具优势。Ji等[12]将PRV gE和gB重组蛋白偶联到磁性微球上，建立了一种可快速检测PRV的双重荧光微球免疫检测方法（fluorescent-microbead immunoassay，FMIA）。结果表明，与ELISA相比，FMIA方法对gE-IgG的特异性、敏感性分别为99.26%和92.30%，对gB-IgG的特异性、敏感性分别为95.74%和96.30%。同时，该方法可准确鉴别PRV野毒株感染和疫苗株免疫应答。曾梦[13]将PRV gE、gB重组蛋白与磁性微球偶联并将其作为捕获载体，分别建立gE、gB IgG抗体单重及双重FMIA方法。分析表明，FMIA方法具有良好的特异性和临床适用性。

免疫学技术作为实验室常规检测技术之一，现已广泛应用于畜禽病原微生物的抗原（抗体）检测。当前，应用于PRV检测的免疫学方法主要包括ELISA、免疫层析技术以及荧光微球免疫检测方法等。其中，ELISA法灵敏度和可重复性较高，且抗体检测结果可以实现定量或半定量分析，在PRV快速检测中表现出良好的临床适用性；免疫层析试纸操作简单、快速，结果可目视判断，适用于现场即时检测；荧光微球免疫检测方法具有灵敏度高、支持抗原/抗体多重检测且可实现靶标快速分离等优势，为PRV快速检测提供了新的支持。但是，上述方法均基于免疫学原理，而抗原抗体具有交叉反应性，所以在特异性方面上述方法仍有待提升。而且动物从感染病原到产生抗体需要时间，因此基于抗体检测的方法具有一定的滞后性，难以实现早期诊断。未来，随着功能性微纳米材料的应用以及多学科的交叉融合，对猪伪狂犬病的检测方法在目标抗体（抗原）捕获、检测时间、结果呈现方式等方面有望得到优化，其灵敏度、特异性以及可重复性等将进一步得到提升。

2 基于核酸的检测方法

2.1 基于PCR的检测方法

2.1.1 常规PCR检测方法

PCR技术是由Kary Mullis于20世纪80年代开发出的一种核酸高效扩增方法[14]。该技术的原理是在DNA聚合酶的作用下，通过变性、退火、延伸等循环变温过程，以引物为起点不断合成与模板链互补的新DNA链。PCR反应完成后，目标序列数量将达到数十亿个拷贝。王豕辰等[15]研究建立的PRV PCR检测方法经优化后，特异性良好，与非PRV病毒无交叉反应性。王凤求等[16]根据PRV gB、gE基因设计引物建立了一种可快速检测PRV野毒株的PCR方法。经临床样品验证，靶向gB和gE的PCR检测结果符合率为100%。

2.1.2 多重PCR检测方法

多重PCR（multiplex PCR）技术是在PCR基础上发展出的一种可同时检测多个靶序列的核酸扩增技术。通过在同一反应管中同时添加多对扩增引物，经条件优化后即可以实现多靶标同时扩增，有效提高了PCR的效率和准确性。王颖旺等[17]根据PRVUL27基因、猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）ORF1基因和猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）N基因设计引物，建立了一种可快速检测PRV、CSFV和PEDV的三重PCR方法。结果表明，该方法对PRV、CSFV、PEDV的检测限分别为12.00、0.05和3.50 pg，且特异性良好。此外，为精准区分PRV疫苗株和野毒株，范克伟等[18]基于PRV gE及gB基因序列设计引物建立了可区分两种毒株的双重PCR方法。基于该方法，PRV野毒株的扩增产物分别为400 bp和582 bp的两条片段，而PRV疫苗株的产物为582 bp的单一片段。经临床样本验证，该双重PCR的检测结果与常规PCR一致。

2.1.3 荧光定量PCR检测方法

荧光定量PCR（qzuantitative PCR，qPCR）是一种可用于精确测定样品中核酸数量的分子技术。与常规PCR不同的是，qPCR可以在反应过程中通过荧光曲线实时反映PCR产物的累积量，具有更高的灵敏度，可以实现靶标定量检测。温书香等[19]基于PRV gE基因设计扩增引物，建立的qPCR方法显示出良好的特异性和可重复性，可用于PRV快速准确定量。蔡晴霞等[20]根据gE基因设计特异性引物及探针，能够准确区分PRV野毒株与疫苗株，且与PCV2、CSFV等其他猪源病毒均无交叉反应性，同时具有良好的可重复性。针对同样的靶标，侯月娥等[21]试验建立的TaqMan qPCR方法可以区别野毒株和基因缺失疫苗株。经检测，该方法可精准检出PRV野毒株感染，且灵敏度比常规PCR高两个数量级。胡铭哲等[22]通过对PRV全基因组进行分析，在PRV Ⅱ型gC基因上筛选出一段不同于PRV Ⅰ型的47 bp的差异序列并分别建立了单重和双重PRV分型检测方法。结果显示，该方法能够准确区分PRV Ⅰ型和Ⅱ型，且针对PRV Ⅰ型、Ⅱ型的最低检测限均为1×104拷贝/μL。

此外，qPCR也可应用于准确定量PRV疫苗的病毒含量。李雪峰等[23]基于PRV gB基因设计引物和TaqMan探针，建立qPCR方法检测PRV灭活疫苗中的抗原含量。经测试，该方法灵敏度高，与其他病毒无交叉反应。华涛等[24]研究表明，qPCR方法可应用于准确检测PRV弱毒疫苗的病毒含量。

2.1.4 数字PCR检测方法

数字PCR（digital PCR，dPCR）是一种用于核酸精准定量检测的新型分子技术，可检测极低浓度的DNA或RNA分子[25]。与qPCR技术相比，dPCR无须制作标准曲线，具有更高的灵敏度、特异性和耐受性，可以实现对样品中目标分子的绝对定量分析。数字PCR可分为两种类型：液滴数字PCR和芯片数字PCR。液滴数字PCR通过在液滴中分离DNA分子，每个液滴内只存在1个或0个DNA分子，之后同时进行PCR扩增并采集荧光信号。根据泊松分布和阳性比例即可以计算出初始样品中的DNA分子数；芯片数字PCR是通过将样品加入微型反应室（通常为10～100 μL）中，每个反应室中有一定数量的DNA分子，之后在芯片上进行PCR扩增和分析。Ren等[26]开发出一种液滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）方法，可应用于快速准确检测PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株。分析结果表明，ddPCR灵敏度高于qPCR，且样品检测结果与qPCR的检测结果具有较高的一致性。

2.1.5 基于PCR的新型检测方法

随着PCR技术的不断进步以及多学科技术的融合发展，基于PCR的新型检测方法在检测PRV感染方面更加灵敏和高效。乌那尔汗等[27]将PCR和核酸斑点进行杂交建立了一种可快速鉴别PRV野毒株和疫苗株的检测方法。结果表明，该方法检测出PRV野毒株与PRRSV、PCV2等其他病毒均无交叉反应。张悦勇等[28]基于gB基因建立了一种可快速检测PRV的纳米PCR方法。结果表明，该纳米PCR方法的检测限为10拷贝/μL，比常规PCR低2个数量级，且具有良好的特异性和临床检测适用性。胡轻轻[29]基于PRV TK和gE基因建立的PCR介导的CRISPR/Cas12a荧光检测报告系统具有灵敏度高、特异性好等优点，而且将侧向层析试纸条与CRISPR/Cas12a结合，无须设备即可实现检测结果快速判读。结果表明，该方法适用于现场快速检测。

2.2 核酸等温扩增方法

2.2.1 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种高效、灵敏、操作方便的核酸扩增技术，可在单一温度条件下对目标基因序列进行快速扩增[30]。陈珍金等[31]根据PRV gB基因序列保守区域设计LAMP扩增引物，并对其灵敏度、特异性进行评估。经临床样品验证，建立的LAMP方法具有良好的特异性，且样本检测结果与qPCR结果具有高度一致性。En等[32]建立的LAMP方法可在63 ℃、1 h内完成PRV DNA扩增。同时，通过Hinc Ⅱ酶对LAMP产物进行消化，验证了方法的准确性和特异性。此外，经临床样本验证，LAMP结果与PCR具有良好的相关性。

2.2.2 重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年来发展起来的一种核酸等温扩增技术[33]。该技术利用重组酶酶促作用启动扩增反应，并基于聚合酶链式反应原理，能够在常温下迅速扩增目标核酸片段。与PCR相比，RPA具有更短的反应时间、更高的灵敏度和特异性。因此，Yang等[34]基于PRV gD基因分别建立实时RPA方法和联合免疫层析试纸（lateral flow dipstick，LFD）应用的RPA-LFD检测方法，RPA可在39 ℃、20 min内完成靶基因扩增。上述两种方法检测限分别为100和160 拷贝/反应，且均具有良好的特异性。为快速鉴别PRV野毒株和疫苗株，刘立兵等[35]基于gB和gE基因设计出特异性扩增引物，建立了一种双重RPA方法，可在20 min内完成对PRV野毒株和疫苗株的区分。同时，该方法具有良好的特异性，针对PRV gB和gE基因的检测限均为102拷贝，与qPCR方法相当。

2.2.3 重组酶介导等温核酸扩增技术

重组酶介导等温核酸扩增技术（recombinase-aided amplification，RAA）是一种近年来发展的核酸扩增方法，利用该技术可在等温条件下快速、准确地扩增DNA或RNA。该方法基于重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白等的协同作用，可以实现对目标序列的高效扩增。Tu等[36]根据PRVgE基因设计引物和探针，建立了一种实时荧光RAA方法以快速检测PRV。结果表明，该方法灵敏度与qPCR相当，且可特异性检出PRV野毒株，与gE基因缺失疫苗株以及其他猪源病毒无交叉反应性。经206份临床样本验证，该方法检测结果与qPCR具有较高的符合率。

基于核酸的检测方法已经成为实验室检测PRV的常用方法。其中，PCR方法因其灵敏度高、特异性好、支持高通量和早期检测等优势，已广泛应用于PRV检测。但是，常规PCR需要使用琼脂糖凝胶电泳观察结果，易造成气溶胶污染；荧光定量PCR和数字PCR虽然简化了检测流程并且具有更优异的检测性能，但目前其相关试剂及仪器成本依然较高，难以推广给资源条件有限的用户；等温扩增技术不同于PCR，无须依赖特殊设备进行循环变温扩增，且结果呈现方式多样，为现场快速检测PRV提供了新的可选工具支持。但目前，核酸等温扩增技术在引物设计、反应体系成熟度以及可重复性等方面仍有待提升，现有方法难以兼顾灵敏度和特异性。随着分子技术的不断进步和多学科技术的交叉融合，期待未来相关技术能不断发展，为实现PRV快速、精准检测提供有力工具支持。

3 结论

目前，在不同场景及应用需求下，基于免疫学的检测方法（包括酶联免疫吸附试验、免疫层析技术以及荧光微球免疫检测方法等）以及基于核酸的检测方法（包括基于PCR的方法以及等温扩增技术等）为PRV检测提供了多种可选工具支持。基于免疫学的检测方法简单、易于操作，可以监测抗体水平。但这类方法容易受到抗原抗体交叉反应影响，存在潜在的误判率。基于PCR的检测方法灵敏、特异，结果可靠。但这些方法对样品的预处理和设备检测等具有一定要求，且不适用于栏边检测。核酸等温扩增方法对设备要求大为简化，且快速便捷，但在技术成熟度等方面仍有待进一步提升。

随着科学技术的不断发展和多学科的融合创新，相关技术将不断进步，同时，基于免疫学和核酸的检测方法也将不断实现优势互补，为快速、精准地检测PRV提供更加灵敏、特异、便捷的方法，以便更好地满足临床实践中多样化的实际检测需求。