整合素α5β1在Hartley豚鼠自发性骨关节炎关节软骨退变中的作用研究*

李 远,李 忠,刘俊才△

(1.遂宁市中心医院骨科中心三病区-关节外科,四川 遂宁 629000;2.西南医科大学附属医院骨科/四川省骨科置入器械研发应用技术工程实验室,四川 泸州 646000)

骨关节炎(OA)是骨科临床最常见的慢性关节疾病,会导致关节疼痛并增加患者的经济负担。由于OA的病因及发病机制目前尚不清楚,临床仅能以延缓进展、缓解症状及晚期矫正畸形、改善功能为治疗目的。因此,原发性OA的防治一直是医学领域研究的热点和难点问题[1]。 近期研究发现,阻断整合素α5β1表达时,有利于抑制大鼠视网膜炎性反应及血管增生,改善视网膜剥脱[2]。α5β1在软骨细胞力学信号转导中的作用最为突出[3]。KHALILI等[3]研究发现,ATN-161是整合素α5β1的拮抗剂,整合素α5β1来源于人纤连蛋白的协同域(PHSRN),其中半胱氨酸残基取代了原序列(PHSCN)中的精氨酸。一些研究表明,在几种肿瘤模型中,无论是作为单一药物还是与放化疗联合使用,ATN-161都能抑制肿瘤的生长、转移和延长患者生存期[3-5]。虽然整合素α5β1在OA 及关节软骨中的研究有不少报道,但其特异性拮抗剂ATN-161在膝OA及软骨退变中的研究在国内外还鲜见报道。据此,本研究拟观察不同月龄豚鼠原发性 OA模型中疾病进展的相关病理改变,进一步研究 ATN-16 对 OA 的治疗效果及机制,从而为临床运用 ATN-161 治疗 OA 提供可靠的理论依据和技术支持。

1 资料与方法

1.1实验动物分组 选取3周龄的SPF级Hartely雌性豚鼠24只,进行1周的适应性喂养并记录初始体重并对其进行编号,然后采用随机分配法将24只豚鼠随机分为基线组、对照组、ATN-161治疗组、生理盐水治疗组,每组6只。其中基线组的豚鼠在实验开始时处死,对照组的豚鼠正常饲养3个月龄时处死,ATN-161的豚鼠在正常饲养3个月后开始予以ATN-161腹腔注射1 mg/(kg·3 d)直至3个月后处死,生理盐水治疗组的豚鼠在正常饲养3个月后开始予以生理盐水腹腔注射1 mg/(kg·3 d)直至3个月后处死。

1.2方法

1.2.1标本的采集和处理 膝关节软骨标本的选取及组织蜡块制作:动物在预定处死时间用颈椎脱臼法处死。动物处死后马上在无菌条件下解剖暴露双后肢膝关节,肉眼大体观察关节面的色泽、光滑度、滑液性状及有无关节面破损并留取影像资料。依据Outerbridge标准,以税利手术刀片在股骨内髁关节负重面同一区域切取软骨标本各6例,大小约1 cm×0.5 cm×0.5 cm,将软骨标本置于10%中性甲醛溶液内固定48 h,流水冲洗2～3 h,混合酸脱钙液脱钙24～48 h,直至大头针能轻松穿透标本,再流水冲洗2～3 h,10%中性甲醛溶液内固定24 h后,常规组织脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋,制成组织块备用。软骨标本苏木精-伊红(HE)及特殊染色,显微组织学观察,Mankin评分及造模成功以及自发性骨关节为进行性判定:软骨组织块3～5 μm厚度全层垂直切片,HE染色制片、番红-固绿与阿利新蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)特殊染色制片及显微镜下形态学观察,观察软骨表面是否规则、有无裂隙,细胞数量、分布、排列是否规则,特染着色部位、分布、均匀度及深浅。根据Mankin评分将软骨损伤(OA)组织病理学改变分为4期。正常软骨 0分;轻度OA 1～<6分;中度OA 6～<10分;重度OA 10～<15分。

1.2.2干预后Hartely豚鼠膝关节软骨的检测指标及方法

1.2.2.1检测指标 大体形态学观察、HE组织学观察、氧化应急指标观察[基质金属蛋白酶(MMP)-13]、力学传导(整合素α5β1)、细胞凋亡(Bax、bcl-2)。检测方法:大体形态学观察:股骨内髁负重关节面的大体形态学改变,包括关节软骨的光滑度、色泽、表面是否有糜烂及溃疡、是否有纤维增生及边缘是否有骨赘形成。HE组织学观察参照Mankin评分标准。血炎症、力学传导、血管生成、细胞凋亡指标观察参照Chemicon公司购买相应检测检测试剂盒检测结果评定标准。为了提高检测准确性,整合素α5β1、Bax、bcl-2的检测采用免疫组化方法。

1.2.2.2免疫组织化学检测 采用免疫组化(SP)法染色,其中抗人整合素α5β1抗体1∶100稀释,二甲联苯胺(DAB)室温下显微镜下调控显色。SP法结果判定参照Jacobs评定方法,由3名病理专业高级职称医师独立读片,其评定误差控制在5%以内,取三者平均值作为最后判定结果;选取5～10个高倍视野(400×),计数每个视野中细胞总数、阳性细胞数及着色程度,显微镜下胞浆或包膜有棕黄色颗粒为阳性细胞;用阳性细胞积分作为整合素α5β1的表达量。依照阳性细胞所占比例分为:0～<25%记为弱阳性(+),25%～<50%记为中等阳性(++),50%～100%记为强阳性(+++)。依照细胞阳性着色程度(抗原含量)分为:弱阳性(+)记为1分,中等阳性(++)记为2分,强阳性(++)记为3分。积分综合计量,积分=弱阳性(+)%×1 +中等阳性(++)%×2+强阳性(+++)%×3,积分<1.0者为(+),1.0～1.5者为中等阳性(++),>1.5者为强阳性(+++)。

2 结 果

HE染色组织学和 Mankin 评分结果显示,对照组豚鼠在3月龄时即发生了OA样改变,并且随着月龄的增长退变逐渐加重,确定造模成功。见表1。组织学和 Mankin 评分结果发现(图2、表2),对照组豚鼠在3个月时即发生了OA样改变,并且随着年龄的增长退变逐渐加重,通过 ATN-161治疗后,ATN-161治疗组豚鼠在6月龄时Mankin评分分值明显减少(P<0.05)。SP法结果证实,α5β1 的表达(图2)在基线组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05),之后随着月龄的增加。生理盐水组中整合素α5β1 的表达高于对照组(P<0.05):与生理盐水组比较,ATN-161组治疗后能明显降低整合素α5β1的表达(P<0.05);随着豚鼠年龄的增加,MMP-3 在软骨中的表达增多(图3),对照组明显高于 BL组,生理盐水组又显著高于对照组(P<0.05);细胞凋亡指标(Bax、bcl-2)(图4、5)免疫组织化学指标均显示:基线组、对照组、ATN-161治疗组三组之间差异有统计学意义(P<0.05)。其中Bax在对照组表达量最低,基线组中最高,ATN-161治疗组表达量明显高于对照组(NS组)(P<0.05);此外,bcl-2在对照组表达量最高,基线组中最低,ATN-161治疗组表达量明显低于生理盐水治疗组(P<0.05)。见表3、4。

注:A.基线组膝关节关节软骨表面光滑、完整;B.对照组可见关节面稍微粗糙,软骨表面可见轻微的纤维化样改变;C.生理盐水治疗组关节面粗糙,不平整,软骨表面出现纤维化改变,切片中细胞排列紊乱,大小不均;D.ATN-161治疗组部分区域关节面较为平整,表层及移行层内软骨细胞增多,胞体肿大。

注:A.基线组α5β1 表达较强,阳性细胞数量多,着色区域广、着色深;B.对照组α5β1 着色区域、颜色较 BL 组都有所减少;C.生理盐水治疗组α5β1 着色区域少颜色很浅;D.ATN-161治疗组α5β1 表达广泛,着色深。

注:A.基线组MMP-3 则基本无表达,着色区域小;B.对照组MMP-3 着色区域、颜色较 BL 组都有所增加;C.生理盐水治疗组MMP-3 表达广泛,颜色深;D.ATN-161治疗组MMP-3 在软骨浅层区域有表达,范围小,颜色浅。

注:A.基线组;B.对照组;C.生理盐水治疗组;D.ATN-161治疗组。

注:A.基线组;B.对照组;C.生理盐水治疗组;D.ATN-161治疗组。

表1 豚鼠体重体重变化情况

表2 Mankin评分结果分,n=8)

表3 定量分析α5β1和MMP-13指标的免疫组化结果

表4 定量分析BXA和Bcl-2的免疫组化结果

3 讨 论

OA的特征是关节软骨进行性丧失,软骨下骨硬化和滑膜炎症,是当今最常见的慢性疾病之一。 因此OA动物模型的制作对于研究疾病的发生发展至关重要。Dunkin-Hartley(DH)豚鼠自发性骨关节炎模型在国内外文献中广泛报道[6-8]。Hartely豚鼠自发性 OA 模型的优点在于:(1)Hartely豚鼠的OA随月龄的增加而逐渐加重,这在很大程度上避免了由手术方式、药物诱导造OA模型对实验本身的影响;(2)Hartely豚鼠OA的膝关节软骨在形态学、影像学、生物化学等方面均与人类OA病理相似,这将更有利于人类OA的研究。本实验采用Hartely豚鼠作为动物模型,有效模拟了人类OA的发生发展过程,为研究ATN-161对 OA的软骨和软骨下骨的作用提供有效保障。本研究结果显示,随着豚鼠月龄的增长,体重逐渐增加,这与既往关于DH豚鼠制作骨关节炎模型的研究结论相吻合[9-10],因此说明本实验成功复制了 OA动物模型。ATN-161是整合素α5β1的拮抗剂,能抑制肿瘤的生长、转移和延长生存期[3-5]。既往研究表明,ATN-161在抑制肿瘤血管生成和其他类型肿瘤转移中有重要作用,但在其特异性拮抗剂ATN-161在膝OA及软骨退变中的研究在国内外还鲜见报道。

WANG 等[11]研究结果表明,软骨细胞自噬的功能可能至少部分涉及糖原的分解代谢。 因此,在患有OA的豚鼠中,胫骨平台软骨细胞自噬水平降低,软骨细胞无法将细胞内糖原降解为葡萄糖,导致软骨细胞能量减少,细胞凋亡增加。大量研究表明,Notch信号通路在调控软骨细胞增殖、分化,维持软骨表型及软骨基质代谢方面有重要作用。MOQBEL 等[12]研究发现线粒体融合促进软骨祖细胞(CPSCs)的软骨形成分化。mitofusin 2(Mfn2) 通过 Notch2 加速 CPSCs 的软骨形成分化。 在体内,rCPSCs 片中的 Mfn2-OE 改善了大鼠模型中的 OA。ZAMLI等[13]研究认为,在Hartely豚鼠自发性骨关节炎模型中,骨关节炎病程进展同软骨细胞凋亡的增加有关。吴绍军等[14]研究发现,Notch信号通路的激活与抑制可以通过凋亡途径改变Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表达情况从而影响大鼠OA的进展。本研究中发现,ATN-161组豚鼠关节软骨免疫组化结果也出现了凋亡指标BXA的下调和Bcl-2上调的变化,充分表明该阻断剂能在一定程度上减缓骨关节软骨退变速度,可抑制Notch信号通路发挥作用。有研究将Notch 信号传导的下游效应物确定为疾病改善骨关节炎药物的潜在靶标[15]。本研究表明,ATN-161能对整合素α5β1起到直接的抑制作用,减少MMP-13的表达,减轻软骨的降解,下调 Bax 蛋白,上调 Bcl-2 蛋白,从而抑制软骨细胞凋亡,进而保护关节软骨,减缓关节软骨的退变速度。ATN-161 可能是一种骨关节炎治疗候选药物。

AMRUTA等[16]通过ATN-161 处理(10 μmol/L) 通过减少整合素α5、MMP-9和纤连蛋白的表达,以及通过减少线粒体超氧化物自由基、细胞内ROS、炎症来减少氧化应激,有效抑制OGD/R诱导的细胞外基质(ECM)沉积通过减少NLRP3炎性体,通过降低claudin-5和ZO-1表达水平导致紧密连接丢失,通过抑制线粒体去极化导致线粒体损伤,通过调节磷酸化黏着斑激酶(p-FAK)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)水平导致细胞凋亡。SUN等[17]研究表明,咖啡酸苯乙酯(CAPE)增加聚集蛋白聚糖和胶原蛋白Ⅱ的表达,以及降低MMP-3、MMP-13和具有整合素α5β1和金属蛋白酶的表达来减弱细胞外基质的降解。可能是预防或治疗OA的潜在治疗剂。总之,本研究结果进一步支持用ATN-161治疗性靶向抑制整合素α5β1改善豚鼠关节软骨的形态,降低氧化应急性损伤,抑制软骨基质中金属蛋白酶MMP-13的表达,进而对骨关节炎起到一定治疗作用。

整合素是广泛存在于人体免疫细胞中的跨膜受体,参与慢性炎症、血栓形成、恶性肿瘤形成等病理过程。它们主要介导细胞间黏附,协调细胞外基质成分的摄取,调节细胞骨架的形成,从而调节细胞信号传导[18-19]。TAO 等[20]从小鼠的膝盖软骨分离细胞,并在各种浓度的纤连蛋白(FN)存在下进行培养并在体外进行增殖,迁移和软骨形成分化测定发现,FN通过整合素α5β1依赖性信号通路增强软骨形成祖细胞(CPC)增殖,迁移和软骨形成分化。基于这些结果,可以开发出一种针对FN靶向激活软骨形成祖细胞(CPC)的新颖而有前途的疗法,以在临床环境中治疗软骨损伤。ATN-161作为整合素α5β1的特异性阻断剂。本研究发现,实验组豚鼠整合素α5β1明显下降,且关节软骨大体形态和组织化学染色评分均高于对照组,这表明ATN-161可能是一种潜在的治疗药物。本研究着重观察了 ATN-161对 DH 豚鼠自发性 OA 软骨改变和保护作用,其具体的作用机制还需要今后进一步研究;此外,钙化软骨是软骨的一部分,也是软骨和软骨下骨重要的连接组织,在OA 中也起着至关重要的作用,ALN 对软骨都具有保护作用,然而ALN 对钙化软骨的作用和机制,也是以后的研究需要补充完善的内容。