枫蓼肠胃康联合5-FU 抑制IL-6/STAT3 通路治疗结肠炎相关性结肠癌的实验研究

汪倩如，钟立璠，黄 凌

（1.海南省药物临床前药理毒理学研究重点实验室，海南 海口 570100；2.海南省创伤与灾难救援研究重点实验室，海南 海口570100；3.海南医学院海南省药物安全性评价研究中心，海南 海口 571199；4.海南医学院药学院，海南 海口 571199）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大癌症，发病率和死亡率逐年上升［1］。结肠炎相关性结肠癌（Colitis-associated colon cancer，CACC）是由活动性结肠炎发展而来的，随着结肠炎严重程度、患病时长以及结肠损伤范围的增加，CACC 的发病率不断提高［2，3］。

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是一种化疗药物，临床上用于治疗结直肠癌、乳腺癌、胃癌等癌症［4，5］。但由于5-FU 首关效应明显，极易产生不良反应及耐药性［6，7］。因此，5-FU 常与其他药物联合给药来提高5-FU 对结肠癌的治疗作用。枫蓼肠胃康（Feng-Liao-Chang-Wei-Kang，FLCWK）由牛耳枫和辣蓼草组成，含有许多化学成分如黄酮类、生物碱类等，具有抗溃疡性结肠炎、抗炎镇痛等作用［8，9］，在临床上主要用于治疗结肠炎、肠易激综合征等症［9，10］。

课题组前期研究发现，枫蓼肠胃康能通过抑制IL-6/STAT3 通路增效5-FU 抑制结肠癌细胞的增殖、促进结肠癌细胞凋亡。本研究采用CACC 小鼠模型，观察CACC 小鼠在给药后结肠组织的病变情况，探讨联合给药对IL-6/STAT3 通路的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

枫蓼肠胃康颗粒购自海口市制药厂有限公司，氟尿嘧啶注射液购自上海旭东海普药业有限公司，IL-6、IL-1β、STAT3、P-STAT3 抗体购自Cell Signaling Technology，Cyclin D1、CDK4、Bax、Bcl-2、βactin 抗体购自Abcam 公司，蛋白浓度测定试剂盒、ECL 发光试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 实验动物

100 只4～6 周龄BALB/c 小鼠，雄性，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2017-0005。

1.3 分组及给药

取小鼠100 只，随机分成5 组，空白对照组10只，AOM/DSS 模型组30 只，FLCWK（4 g/kg）组、5-FU（24 mg/kg）组、5-FU（24 mg/kg）+FLCWK（4 g/kg）联合给药组各20 只。FLCWK 组和联合给药组从造模第1 天开始灌胃注射FLCWK 溶液；5-FU组和联合给药组在造模结束前一周开始尾静脉注射5-FU，1 d 注射1 次，共7 次。

1.4 建立CACC 动物模型

造模开始时，空白对照组腹腔注射生理盐水，AOM/DSS 模型组、FLCWK 组、5-FU 组、5-FU+FLCWK 联合给药组小鼠腹腔注射12.5 mg/kg AOM。一周后，除空白对照组以外其他组小鼠饮用含2.5%DSS 饮用水一周、正常饮用水2 周，以此为一个循环，共反复3 个循环建立CACC 小鼠模型（见图1）。造模结束后处死小鼠，取盲肠到肛门部位，沿着结肠组织纵轴方向将其切开，用生理盐水将粪便清洗干净，观察肠内膜肿瘤病变情况。然后取部分结肠放入4%中性甲醛固定，其余组织放入-80 ℃保存进行后续蛋白检测试验。

图1 造模后各组小鼠体重及DAI 变化Fig 1 Changes in body weight and DAI of mice in each group after modeling

1.5 小鼠一般情况观察

饲养期间每2 日观察并记录各组小鼠的饮食、精神、毛发及活动状态，观察小鼠的疾病活动指数（DAI）、结肠长度、成瘤率、肿瘤大小变化等。小鼠疾病活动指数（DAI）=（体重下降分数+大便性状分数+便血分数）/3。

表1 DAI 评分标准Tab 1 DAI scoring standard

1.6 Western blot 检测小鼠结肠组织IL-6/STAT3通路相关蛋白的表达

提取蛋白，BCA 蛋白定量后上样。浓缩胶90 V恒压，分离胶120 V 恒压，样品迁移至底部时切下目的蛋白区域凝胶，将滤纸、凝胶、PVDF 膜夹成三明治样子进行转膜。200 mA 恒流转膜1 h 后，将PVDF 膜取出放入5%脱脂奶粉或BSA 中封闭2 h。TBST 洗膜3 次后加入一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3 次，加入二抗孵育1.5 h，TBST 洗膜3 次后进行显影。

1.7 HE 染色观察结肠组织病理学变化

将固定好的结肠组织进行脱水、包埋、切片，将载玻片放入60 ℃烘箱中烘烤过夜后进行染色：二甲苯脱蜡、乙醇浸泡、苏木素染色、盐酸分化、伊红染色、脱水、透明、中性树胶封片。

1.8 统计学处理

利用统计学分析软件SPSS26.0、Graph Pad Prism8.0 对实验数据进行分析，结果均以平均值±标准误（Means ± SEM）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）对实验数据进行分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FLCWK 联合5-FU 对小鼠状态的影响

如图1 所示，在饮用DSS 期间，小鼠体重明显下降，活动减少，严重的出现便血、腹泻；当把DSS换成正常饮用水后，这些症状逐渐缓解，体重逐渐恢复正常。第三个饮用水阶段，小鼠体重增加，尾静脉注射5-FU 后，5-FU 组与联合给药组的小鼠体重均有所下降，而FLCWK 组小鼠则表现出良好的精神状态，症状也较轻。饮用DSS 期间，除空白组外的各组小鼠疾病活动指数（DAI）明显上升，把DSS 换成正常饮用水后，DAI 逐渐下降。

采用AOM/DSS 造模后，第70 天处死小鼠，取盲肠到肛门部位，沿着结肠组织纵轴方向将其切开，用生理盐水将粪便清洗干净，测量结肠长度并观察肿瘤大小。如图2 所示，空白组小鼠结肠肠壁通透，未观察到肿瘤；模型组小鼠全部成瘤，肠壁增厚，能明显观察到有多个肿瘤分布其上，且结肠长度明显缩短（P<0.01）；与模型组相比，FLCWK 组、5-FU 组及联合给药组小鼠结肠长度均显著增长（P<0.01），全部成瘤但可观察到肿瘤数目明显减少、肿瘤大小相比模型组更小。

图2 造模后各组小鼠结肠长度Fig 2 Colonic length of mice in each group after modeling

2.2 FLCWK 联合5-FU 对小鼠存活率的影响

如图3 所示，第一个DSS 饮用期间，模型组小鼠死亡率最高，有近1/3 的小鼠死亡；第二个DSS 饮用期间，各组小鼠均无死亡；第三个DSS 饮用期间，各组小鼠均有死亡。FLCWK 组和5-FU 组小鼠存活率较模型组显著升高，联合给药组的小鼠存活率较FLCWK 组和5-FU 组高。

图3 各组小鼠存活率Fig 3 Survival rate of mice in each group

2.3 FLCWK 联合5-FU 对IL-6/STAT3 通路相关蛋白的影响

如图4 所示，采用AOM/DSS 造模后，模型组小鼠P-STAT3、IL-6、IL-1β 蛋白表达明显上升； FLCWK 与5-FU 联合给药后，P-STAT3、IL-6、IL-1β 的表达相比模型组明显下降（P<0.01）。STAT3 的表达在造模及给药后无明显差异。实验结果表明，FLCWK 联合5-FU 给药能更有效的抑制PSTAT3、IL-6、IL-1β 的表达。

图4 Western blot 检测CACC 小鼠结肠P-STAT3、STAT3、IL-6、IL-1β 的表达Fig 4 Western blot detection of colonic P-STAT3， STAT3， IL-6， IL-1β expression in CACC mice

如图5 所示，用AOM/DSS 造模后，Cyclin D1、CDK4 以及Bcl-2 的表达上升，Bax 的表达明显下降。FLCWK 联合5-FU 给药显著降低了Cyclin D1和 CDK4 的表达（P<0.01）、上调了Bax 的表达（P<0.01）。

图5 Western blot 检测CACC 小鼠结肠Bax、Bcl-2、Cyclin D1、CDK4 的表达Fig 5 Western blot detection of colonic Bax， Bcl-2， Cyclin D1， CDK4 expression in CACC mice

2.4 FLCWK 联合5-FU 对小鼠结肠病理学的影响

如图6 所示，空白对照组细胞排列整齐，无炎性细胞浸润。模型组可以观察到结肠表面有多发性息肉样及结节状肿物，杯状细胞排列不规则，隐窝结构发生改变，核增大，核分裂常见，基底大量淋巴细胞聚集，肠壁增厚，符合CACC 诊断标准。FLCWK 和5-FU 单独给药组，细胞排列相比模型组较整齐，炎性细胞浸润较模型组均有减轻；联合给药组细胞排列明显整齐，炎性浸润明显减轻。

图6 各组小鼠HE 染色情况示意图（×200）Fig 6 Schematic diagram of HE staining in each group of mice（×200）

3 讨论

结肠癌发病率高且死亡率高，年轻人患结肠癌的概率也在逐年增加，寻找有效的药物及靶点治疗结肠癌已成为当前研究的热点［11］。结肠癌的发生发展，与多种信号转导途径相关，其中IL-6/STAT3是一条经典的信号通路，激活IL-6/STAT3 信号通路会导致细胞增殖的发生，促进癌症的发展［12］。

有研究表明，IL-6/STAT3 通路的异常激活与CyclinD1、Bcl-2 等过度表达而导致肿瘤细胞过度增殖和凋亡抑制有关［13］。Bcl-2 及Bax 在细胞凋亡过程中发挥重要的作用［14］。Bax 与Bcl-2 形成异源二聚体，当Bax/Bcl-2 比值下降时，抑制细胞凋亡［15-17］。Cyclin D1 及CDK4 参与肿瘤细胞的发生与发展，细胞分裂失调引起的细胞增殖异常是肿瘤标志性特征之一。从细胞周期的一个步骤进行到下一个步骤是由周期蛋白依赖性激酶（CDKs）控制的［18］。当受到刺激时，细胞周期蛋白D 会和CDK4 发生相互作用［19］。肿瘤细胞中，CDK4 与Cyclin D1 的激活导致细胞一直分裂，促进肿瘤生长［20］。

本实验采用CACC 小鼠模型，观察FLCWK 联合5-FU 给药后对小鼠的治疗作用。结果发现，FLCWK 联合5-FU 给药显著提高了小鼠的存活率，减轻了小鼠肠壁增厚及间质炎症情况。FLCWK 联合5-FU 能够抑制STAT3 的磷酸化、抑制IL-6 及IL-1β 的表达；同时能够抑制Cyclin D1、CDK4、Bcl-2 的表达，上调Bax 的表达。

采用氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）建立CACC 小鼠模型，HE 染色观察小鼠结肠病理变化，Western blot 检测IL-6/STAT3 通路相关蛋白的表达。结果发现，FLCWK 联合5-FU 能够抑制IL-6/STAT3 通路来发挥对CACC 的抑制作用。

作者贡献度说明：

汪倩如：设计实验、进行实验、分析数据、撰写论文；钟立璠：设计实验、论文修改；黄凌：提供研究思路、指导论文撰写及修改。所有作者声明不存在利益冲突关系。