间充质干细胞调节LXA4对糖尿病肾病大鼠的影响

李亚玲 凡 洋 雷 蕾 白彝华

随着糖尿病发生率的日益增加,作为糖尿病的主要微血管并发症之一,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)也已变成一个世界性的公共卫生问题[1]。DN的发生涉及多种炎性细胞和分子的参与,包括白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin -8,IL-8)、干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)及趋化因子-1(CXCL1)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等[2,3]。上述各种因素促进TGF-β1的转录和表达,活化的TGF-β1与其受体相互作用激活Smad依赖和非Smad依赖的下游信号,尤其是Smad2和Smad3[4]。其中Smad3是各种促纤维化介质包括TGF-β、血管紧张素转换酶Ⅱ和晚期糖基化终产物的主要促纤维化转录因子[5,6]。

脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)是花生四烯酸经脂氧合酶催化后的产物,能够抑制多形核中性粒细胞的趋化,对炎性细胞和炎症相关基因产生负性调节,其还能抑制单侧输尿管梗阻和TGF-β1刺激的肾成纤维细胞中Smad2、Akt 和促分裂原活化蛋白激酶的激活[7,8]。在前期的研究中,通过对DN的动物模型进行骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)干预,人们发现其肾脏纤维化指标和炎性细胞因子减少,这表明MSC可以减轻DN引起的肾脏损伤和炎性反应[9]。然而在DN中,移植MSC后其炎症减轻和纤维化改善是否与LXA4有关尚不明确。本研究拟建立DN大鼠模型和细胞模型,分别予MSC、LXA4和LXA4拮抗剂WRW4等不同的处理,探讨MSC在DN中的作用机制。

材料与方法

1.主要试剂与仪器:链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)、脂氧素A4(LXA4)、脂氧素A4抑制剂(WRW4)购自大连Meilunbio公司;PBS、SDSPAGE购自北京Solarbio科技有限公司;大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)和大鼠MSC购自广州赛库生物技术有限公司;EDTA-胰酶购自美国Millipore公司;TGF-β、IL-6、IL-8、IFN-γ试剂盒购自深圳欣博盛生物科技有限公司;BCA试剂盒、RIPA裂解液购自武汉Servicebio公司; p-Smad2抗体、p-Smad3抗体、Smad2、Smad3抗体、CXCL1抗体、CXCR2抗体购自江苏Affinity公司;β-actin购自英国Abcam公司;QuickGel 6100成像系统购自中国Monad公司。

2.动物模型的建立及分组:雄性SD大鼠,8周龄,体质量为180g～220g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,生产许可:SCXK(京)2019-0008。适应性喂养1周后,禁食12h,随机分为糖尿病肾病(DN)组30只和正常对照(Normal)组6只。以腹腔注射STZ诱导糖尿病模型,将STZ溶液[临用前用枸橼酸钠缓冲液(11mol/L, pH值4～5)配制]抽吸于1ml注射器按65mg/kg的剂量注射至大鼠的左下腹腹腔,10min内用完;Normal组则给予等量枸橼酸钠溶液。72h后对大鼠尾静脉采血进行随机血糖检测,并使用尿糖试纸定性大鼠随机尿的尿糖水平,经检测随机血糖≥16.7mmol/L,尿糖定性(+++～++++),认为成功建立糖尿病模型;完成糖尿病大鼠建模4周后,留取其24h尿并测定尿蛋白,如>30mg/24h,认为DN建模成功[10]。将建模成功的DN大鼠分为DN组、DN+MSC组、DN+LXA4组、DN+LXA4+WRW4组、DN+MSC+WRW4组,每组6只。DN组(继续正常喂养),DN+MSC组(尾静脉注射MSC,5×106/0.5ml PBS)、DN+LXA4组(腹腔注射LXA4,10mg/kg)、DN+LXA4+WRW4组(腹腔注射LXA4,10mg/kg)和WRW4(1mg/kg)、DN+MSC+WRW4组(尾静脉注射MSC,5×106/0.5mlPBS,每周1次,连续2周;同时腹腔注射WRW4,1mg/kg)。继续喂养6周,期间每2周测1次血糖,实验结束最后 1天,留取24h尿液标本-18℃保存备检。颈椎脱臼法处死大鼠后立即采集肾脏标本,称体质量,冷PBS清洗,快速液氮冷冻以抽提蛋白。

3.细胞培养:大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)和大鼠MSC分别将接种于含10%FBS的培养基中,置于37℃、5%CO2培养箱中,用EDTA-胰酶消化,待细胞间隙增大,细胞变圆时终止消化。待细胞占整个T25-培养瓶底部80%～90%时传代、洗涤、再次消化,将细胞吹打均匀,吹打后将细胞悬液分装至新的培养瓶内,加入适量新鲜培养基以正常培养条件培养。HBZY-1加入高糖(high glucose,HG)(30mmol/L)培养72h后,对细胞进行分组处理,实验按6个组进行:Normal (正常对照)组;高糖组;高糖+MSC(MSCs以4×105细胞/孔的密度接种在Transwell小室的底部隔室中,不与HBZY-1细胞直接接触。)组;高糖+LXA4(100nmol/L)组;高糖+LXA4(100nmol/L)+WRW4(10μmol/L)组;高糖+MSC+WRW4(10μmol/L)组,培养48h后,收集细胞和上清液做相关检测。

4.ELISA检测HBZY-1细胞上清液中TGF-β、IL-6、IL-8、IFN-γ 的含量:严格按照TGF-β、IL-6、IL-8、IFN-γ试剂盒说明书操作,450nm波长处测定各孔的吸光度(A)值,再以建立的标准曲线换算出检测指标的真实含量,以皮克/毫升(pg/ml)表示。

5.Western blot法检测HBZY-1细胞中p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、CXCL1、CXCR2蛋白表达情况:冰上裂解细胞后抽提总蛋白,BCA法(根据BCA测定试剂盒说明书操作)蛋白定量后,10μl蛋白上样,10% SDS PAGE凝胶电泳,转膜,5%的牛血清白蛋白室温封闭30min,分别加入p-Smad2抗体(1∶500),p-Smad3抗体(1∶500),Smad2抗体(1∶1000),Smad3抗体(1∶1000),CXCL1抗体(1∶1000),CXCR2(1∶1000),4℃冰箱内过夜。次日TBST溶液洗膜3次,以HRP标记的相应二抗(1∶5000)室温孵育30min,再次洗膜后,以β-actin为内参,经凝胶成像系统QuickGel 6100处理并分析图像。

6.Western blot法检测大鼠肾脏组织中p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3、CXCL1、CXCR2蛋白表达情况:每份样品称取肾组织50mg,加入800μl RIPA裂解液,在冰上充分研磨后,离心15min(转速16000r/min),取2μl上清液,BCA法蛋白定量。10% SDS-PAGE凝胶电泳,转膜,5%的牛血清白蛋白(BSA)室温封闭30min,分别加入p-Smad2抗体(1∶500)、p-Smad3抗体(1∶500),Smad2抗体(1∶1000),Smad3抗体(1∶1000),CXCL1抗体(1∶1000),CXCR2(1∶1000),4℃冰箱内过夜。次日TBST溶液洗膜3次,以HRP标记的相应二抗(1∶5000)室温孵育30min,再次洗膜后,以β-actin为内参,经凝胶成像系统QuickGel 6100处理并分析图像。

结 果

1.细胞培养ELISA结果:与正常对照组比较,高糖组肾小球系膜细胞TGF-β1、IL-6、IL-8和IFN-γ表达升高(P<0.001)。与高糖组比较,高糖+MSC组和高糖+LXA4组肾小球系膜细胞TGF-β1、IL-6、IL-8、IFN-γ表达降低(P<0.001)。与高糖+MSC组和高糖+LXA4组比较,经WRW4抑制后,高糖+MSC+WRW4组和高糖+LXA4+WRW4组肾小球系膜细胞TGF-β1、IL-6、IL-8、IFN-γ表达升高(P<0.001,表1)。

表1 肾小球系膜细胞TGF-β1、IL-6、IL-8和IFN-γ蛋白的表达

2.细胞培养Western blot法检测结果:与正常对照组比较,高糖组p-Smad2、p-Smad3以及 CXCL1、CXCR2表达增高(P<0.05);与高糖组比较,高糖+MSC组和高糖+LXA4组p-Smad2、p-Smad3和 CXCL1、CXCR2表达减弱(P<0.05);与对应的高糖+MSC组和高糖+LXA4组比较,高糖+MSC+WRW4组和高糖+LXA4+WRW4组p-Smad2、p-Smad3、CXCL1、CXCR2表达增加 (P<0.05,图1～图4)。

图1 肾小球系膜细胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白免疫印迹分析

图2 肾小球系膜细胞中p-Smad2、p-Smad3相对表达量

图3 肾小球系膜细胞中CXCL1、CXCR2蛋白免疫印迹分析

图4 肾小球系膜细胞中CXCL1、CXCR2相对表达量A.CXCL1;B.CXCR2

3.大鼠实验Western blot法检测结果: DN组大鼠肾脏组织中p-Smad2、p-Smad3、CXCL1、CXCR2表达均高于正常对照组(P<0.01);DN+MSC组和DN+LXA4组肾脏组织中p-Smad2、p-Smad3、CXCL1、CXCR2表达低于DN组 (P<0.001)和相对应的DN+MSC+WRW4组、DN+LXA4+WRW4组 (P<0.05,图5～图8)。

图5 肾脏组织中p-Smad2、p-Smad3蛋白免疫印迹分析

图6 肾脏组织中p-Smad2、p-Smad3相对表达量

图7 肾脏组织中CXCL1、CXCR2蛋白免疫印迹分析

图8 肾脏组织中CXCL1、CXCR2相对表达量

讨 论

DN是世界范围内最常见的慢性肾脏疾病,也是终末期肾衰竭的主要原因[11]。代谢异常(如高血糖、高血压和血脂异常)、血流动力学变化、肾素-血管紧张素系统激活和氧化应激等参与了DN的发病[12]。然而DN的发展是复杂且多样的,近年来有研究发现,在DN动物模型和患者中,炎性介质的循环水平和巨噬细胞对肾组织的渗透均增加[13]。趋化因子CXC基序配体-1(CXCL1)作为一种有效的促炎因子,主要表达于中性粒细胞、巨噬细胞和上皮细胞,它通过与受体CXCR2相互作用,在中性粒细胞和单核-吞噬细胞的浸润中发挥重要作用[14]。激活的干扰素-γ(INF-γ)参与了慢性肾脏疾病的炎性反应[15]。以上这些发现均强调了炎性反应在DN肾脏损害方面的重要性。事实上,最初的炎性反应旨在保护宿主,抑制上皮再生,有利于伤口的愈合以及稳定受损的肾单位,但是当炎症没有及时消退时,将出现肾小球系膜细胞基质增生、成纤维细胞增殖、足细胞损伤等病理过程,最终导致肾小球硬化及间质纤维化[16,17]。而肾脏纤维化是DN进展为慢性肾衰竭的病理基础。

骨髓MSC具有巨大的自我更新和分化潜能,近年来被用于系统或局部治疗多种疾病[18,19]。有研究发现,骨髓MSC可降低肾间质纤维化相关指标如TGF-β、胶原纤维-Ⅰ、纤维连接蛋白、α平滑肌肌动蛋白和钙黏蛋白E(E-cadherin)的表达,减少炎性介质MCP-1 和 TNF-α的表达[9]。然而,在DN中MSC调控其纤维化和炎症的机制目前尚不完全清楚。LXA4是一种在急性炎性反应中产生的二十烷类化合物,通过G蛋白偶联受体/甲酰肽受体2促进炎症的消退,同时LXA4介导的let-7c基因上调能够抑制TGF-β1诱导的肾脏纤维化[20,21]。糖尿病引起的肾脏纤维化和炎症均与TGF-β/Smad2/3信号通路的激活有关[22]。TGF-β通过其配体、受体和下游的Smads分子对DN进行多种调节,活化的TGF-β1与2型跨膜受体结合导致1型跨膜受体磷酸化,促发细胞内底物Smad2和Smad3的磷酸化(p-Smad2和p-Smad3)[4]。而抑制p-Smad2或p-Smad3可减轻急性肾损伤(AKI)的炎症损伤[23,24]。

这些研究表明,p-Smad2或p-Smad3在DN的发病过程中有着重要作用。

本研究发现,HG刺激后,HBZY-1细胞中纤维化指标TGF-β1和促炎性细胞因子IL-6、IL-8和INF-γ以及CXCL1、CXCR2的水平均增加,通过MSC和LXA4治疗后,HBZY-1细胞中TGF-β1、IL-6、IL-8、INF-γ和CXCL1、CXCR2表达均减少,这些结果表明MSC或LXA4干预均能延缓DN的肾脏纤维化和炎症进展。为了检测LXA4与MSC保护作用是否存在一定联系,笔者使用LXA4受体拮抗剂WRW4来阻断其下游信号通路。结果表明,WRW4抑制了MSC的保护作用。而给予LXA4和MSC显示出类似的保护作用,提示LXA4在MSC对DN肾损伤的保护机制中起着重要作用。在体内实验和体外实验的结果中,均显示 MSC或LXA4干预能过够下调DN细胞和大鼠模型肾脏组织中p-Smad2和p-Smad3的表达。这表明MSC或LXA4处理均能抑制TGF-β/Smad的信号转导。然而,WRW4的干预抑制了上述作用。这提示MSC干预可抑制DN中肾脏的纤维化和炎性细胞因子表达,MSC对DN的这种肾脏保护,其作用机制可能是提高了DN肾组织中LXA4的表达而实现的。

综上所述,在DN的病理发展过程中炎症和纤维化起着重要作用,MSC对HG刺激的肾脏细胞和STZ诱导的DN大鼠中肾脏组织的纤维化和炎症发展具有明显的治疗作用, MSC对DN发挥保护作用的重要机制很可能是提高了LXA4的表达,这为MSC治疗DN的潜能提供了新的靶点和理论参考。