被动运动对KOA大鼠关节软骨IL-1β、MMP-13表达的影响

陆永莉 李辉 王文彪,

(1新乡医学院,河南 新乡 453000; 2新乡医学院第一附属医院)

膝关节骨性关节炎(KOA)是一种多种因素引起的、以关节软骨变性破坏为主要特征的慢性、进展性关节疾病,其发病率、致残率高,是导致老年人残疾和生活质量下降的主要原因〔1～3〕。目前,KOA病因及发病机制尚不完全清楚,多认为与力学因素和生物学因素的相互作用导致关节软骨细胞、细胞外基质和软骨下骨的合成与降解失衡〔4～7〕,使膝关节周围肌力下降、关节失稳和疼痛三者之间形成恶性循环有关〔8〕。运动疗法作为物理治疗中应用最广泛的方法,不仅有助于阻断这种恶性循环,减缓关节软骨损害,还能提高关节稳定性,改善关节功能,减轻疼痛程度和活动受限〔9～11〕,提高患者膝关节活动能力和生活质量〔12,13〕,在临床应用中效果显著。手术诱导骨关节炎(OA)动物模型的证据也表明中度运动可以延迟软骨退化的进展〔1〕。但目前研究多倾向于主动运动,忽略了被动运动对KOA的影响,关于被动运动的基础实验研究更是少见。

因此,本研究旨在从大鼠KOA模型角度验证被动运动治疗KOA的有效性,观察被动运动对KOA大鼠关节软骨白细胞介素(IL)-1β、基质金属蛋白酶(MMP)-13表达的影响,探讨被动运动治疗KOA的机制,以期更好服务于临床,为临床康复治疗KOA提供新的治疗思路和治疗方法。

1 材料和方法

1.1实验动物 2～3月龄的健康雌性SD大鼠30只,体质量(300±30)g。适应性喂养1 w后,随机选取10只作为空白组,其余20只采用关节腔内注射木瓜蛋白酶法制备KOA大鼠模型,并于造模完成后随机选取10只造模大鼠作为被动运动组,给予被动运动干预,剩余10只为模型组。实验动物质量合格证号:1107261911005590,实验动物使用许可证号:SCXK(鲁)20190003。本实验于新乡医学院第一附属医院生命科学研究中心进行,实验操作均符合新乡医学院动物实验伦理委员会的要求。

1.2模型制备 采用关节腔内注射木瓜蛋白酶法造模〔14～18〕:在无菌条件下用0.9%氯化钠溶液配制6%(W/V)木瓜蛋白酶溶液和 0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液,储存于4 ℃冰箱,于实验前4 h取出室温放置,注射前30 min将6%的木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L的 L-半胱氨酸溶液按2∶1的比例混匀。将模型组和被动运动组腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉,麻醉成功后双膝关节备皮、消毒、屈曲约45 °,从髌骨下缘前内侧膝眼向髁间窝方向进针,明显有落空感后,针尖抵达股骨内侧髁再回撤2 mm,注入6%木瓜蛋白酶与L-半胱氨酸的混合溶液0.30 ml至右侧膝关节腔。左侧膝关节腔用同样方法注射0.30 ml 生理盐水作为对照。实验开始后的第4、7天分别再注射1次。在注射完成后标准饲养大鼠28 d,模型造模完成。在造模完成后1 w,随机抽取每组大鼠各2只处死,以检验造模成功与否。

1.3被动运动干预 戴上皮质捕鼠手套,用大拇指和食指固定大鼠颈部,食指和中指固定大鼠腹部,小指固定大鼠尾巴,刚好暴露大鼠四肢,且不影响其活动。然后另一手拉出大鼠右后肢,抓住大鼠趾部,使其与脊柱呈45 °并向后外方牵拉,直至大鼠右后肢完全伸直(膝关节、踝关节完全伸直),然后再向与牵拉方向相反的方向,将大鼠右后肢推向身体使之完全屈曲紧贴身体(膝关节完全屈曲,踝关节完全背曲),如此一个往复为一个周期。大鼠右后肢被动运动施加频率为一天2次,每次不少于3 min,大鼠每侧后肢每天共活动600个周期。整个过程中要动作轻柔,速度适中,全关节幅度活动,运动持续时间4 w〔19～21〕。

1.4标本获取 将大鼠过量麻醉处死,仰位固定并打开右膝关节腔,分离前后交叉韧带和内侧副韧带,截取大鼠膝关节股骨端附带少量软骨下骨作为标本,去除周围软组织,4%中性甲醛固定24 h,脱钙完成后进行石蜡包埋,制成组织切片备用。

1.5主要观察指标

1.5.1造模后一般情况观察 肉眼观察造模完成后每组大鼠的饮食、饮水、精神状态、毛色的光泽度、自由活动情况等。

1.5.2大体观察 解剖各组处死大鼠,充分暴露大鼠右侧膝关节,观察各组关节软骨表面是否光滑、有无糜烂及溃疡、色泽和透明度变化、有无纤维性增生及边缘是否有骨赘形成等〔22〕。

1.5.3关节液的采集及IL-1β含量检测 吸取0.2 ml生理盐水于注射器中,沿关节间隙注射入关节腔,再回抽出生理盐水与滑膜液的混合液,如此反复抽吸3次,收集抽取的液体,-80 ℃冰箱保存〔23〕。采用双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)按照试剂盒严格操作检测IL-1β含量。

1.5.4软骨组织形态学观察及Mankin评分 组织连续切片4～6 μm,分别行苏木素-伊红(HE)染色、甲苯胺蓝染色及番红O-固绿染色,荧光显微镜下观察软骨组织形态、细胞簇集及排列是否整齐、基质染色、软骨表面裂隙及纤维化等情况。每个样本分别于内、外侧各取3张切片,测量软骨表面至潮线表面厚度并对病理学切片进行Mankin评分〔24〕。

1.5.5软骨细胞中MMP-13表达 采用免疫组织化学法,将连续切片置于烤片机上烤片1 h,脱蜡及水化后抗原修复30 min,灭活组织切片中的内源性过氧化物酶和生物素,牛血清白蛋白封闭1 h,加一抗4 ℃孵育过夜,回收一抗,加二抗室温孵育30 min,二氨基联苯胺(DAB)显色液显色,苏木素复染细胞核,晾干封片后光镜下观察,用ImageG软件进行细胞计数。

1.6统计学方法 采用SPSS25.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1造模后一般情况 造模后大鼠较之前精神萎靡,饮食、饮水及活动量减少,毛色暗淡,注射侧膝关节肿胀,活动时注射侧肢体着地减少。

2.2大体观察 正常组关节软骨透明度好,呈灰白色,软骨表面光滑;模型组关节软骨透明度差,颜色变暗,软骨层变薄,软骨表面不光滑,关节滑液明显增多;被动运动组软骨色泽较模型组明显改善,软骨层增厚,关节滑液减少。 见图1。

图1 各组关节软骨大体观察

2.3软骨组织形态学观察 光镜下观察软骨组织标本,HE染色见正常组软骨细胞排列整齐,层次分明;模型组软骨细胞明显减少,排列紊乱,出现裂隙;被动运动组软骨细胞较模型组增多,排列稍整齐,层次较清楚。甲苯胺蓝染色和番红O固绿染色见正常组软骨基质染色深且均匀,软骨各层清楚可辨,潮线连续完整;模型组软骨基质染色弱且不均,软骨层变薄,潮线不清;被动运动组较模型组明显改善,软骨基质染色加深,软骨层增厚,潮线较清楚。见图2。

图2 各组软骨组织形态学及软骨细胞中MMP-13表达(DAB,×400)

2.4各组Mankin评分比较 模型组Mankin评分〔(7.7±0.948 68)分〕最高,被动运动组〔(4.3±0.948 68)分〕明显低于模型组、明显高于正常组〔(0.2±0.421 64)分〕,各组间比较差异显著(P<0.05)。

2.5各组IL-1β含量和MMP-13表达比较 与正常组比较,模型组及被动运动组IL-1β含量明显升高(P<0.05);与模型组比较,被动运动组IL-1β含量明显降低(P<0.05)。免疫组织化学染色可见阳性细胞胞质和胞核均着棕黄色。与正常组比较,模型组及被动运动组MMP-13表达水平显著升高(P<0.05);与模型组比较,被动运动组MMP-13表达水平显著降低(P<0.05)。见图2、表1。

表1 各组IL-1β含量和MMP-13表达比较

3 讨 论

KOA主要病理学改变是关节软骨变性、破坏、软骨下骨反应性增生和骨赘形成〔25〕。KOA的一个显著特征是关节软骨的进行性退化,研究表明,软骨细胞赖以生存的细胞外基质的合成与降解失衡是导致软骨退变的重要原因之一,软骨基质的降解和炎性细胞因子的产生对KOA的病理进展至关重要〔26〕。运动疗法是目前KOA治疗中公认的有效方法,有研究表明,运动疗法能在提高KOA患者关节活动度的同时,减轻疼痛并改善膝关节功能,使76%的患者免于关节置换手术〔27〕。国外也早在2001年就提出将运动疗法作为治疗膝骨性关节炎的首选〔28〕。但目前有关被动运动的基础研究甚少,其作用机制也不明确。

本研究采用关节腔内注射木瓜蛋白酶法制备KOA大鼠模型,木瓜蛋白酶诱导KOA成功率高、时间短、重复性好〔29〕,对胶原蛋白和软骨细胞没有直接影响,只通过对细胞外基质中的蛋白多糖影响来破坏胶原蛋白的整合〔14〕,因此可以形成与人类KOA相似的病变。本实验中,注射木瓜蛋白酶4 w后,即可见软骨细胞的减少和排列紊乱,与人类早期KOA一致。本实验结果表明,被动运动对KOA大鼠具有一定的治疗作用,可以改善关节软骨的退变与破坏,能够在一定程度上促进关节软骨损伤的修复。

MMPs是软骨基质降解中最重要的酶之一〔30〕。MMP-13是靶向软骨降解的主要酶,与其他 MMP 相比,MMP-13 的表达更局限于结缔组织,在骨关节炎关节软骨和Ⅱ型胶原蛋白降解中发挥重要作用〔31〕。本实验表明,被动运动可以抑制关节软骨组织中MMP-13表达,使关节软骨的降解减少,对关节软骨具有一定的保护作用。

炎性因子在KOA的发生和发展过程中也起着重要作用,它们参与了膝关节的新陈代谢,对于维持膝关节内环境的稳态具有重大影响,其中IL-1β被认为是导致KOA产生的关键因素,其可以独立诱导炎症反应和软骨分解,也可以和其他介质一同发挥致炎作用〔32〕。有研究表明,IL-1β能通过抑制软骨细胞合成蛋白聚糖及细胞增殖影响关节软骨的退变〔31〕。本实验表明,被动运动可以通过降低关节滑膜液中IL-1β含量来减轻炎症,改善KOA大鼠症状。

综上,被动运动可通过降低KOA大鼠关节液中IL-1β含量减轻炎症反应;抑制软骨细胞中MMP-13表达,可减少软骨基质降解,促进关节软骨的损伤修复。关于具体的治疗机制,有待进一步研究。