地衣芽孢杆菌对鲫鱼免疫功能、抗氧化能力及肠、肝组织结构的影响

2023-10-10么宝兰刘芸娜闫子豪李月红

饲料工业 2023年18期

■ 么宝兰刘芸娜刘佳闫子豪李月红

（吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130118）

近年来，抗生素在水产养殖中的滥用引发出一系列耐药性和环境问题，为了寻求更好的解决办法，越来越多的学者尝试将益生菌应用到水产养殖中。芽孢杆菌是益生菌中常见的菌种，其中地衣芽孢杆菌在芽孢杆菌中是最具应用前途的菌种，因其安全、耐热、能分泌多种酶和产酶量高等优点而备受关注。地衣芽孢杆菌易形成孢子，比较适合于添加到饲料中，能够降解饲料中的营养物质，使其被水产动物的肠道更加充分的吸收和利用。有研究表明，地衣芽孢杆菌不仅能够增强水产动物机体免疫力，预防水产动物的疾病，还可以有效分解水体中的有害物质。最重要的是能够平衡肠道菌群，抑制致病菌的生长繁殖[1]。

嗜水气单胞菌是一种重要的革兰氏阴性、能动的杆状细菌，是一种生活在淡水中的人畜共患病细菌，可导致水生动物、陆生动物和人类感染，广泛存在于各种水体中[2]。嗜水气单胞菌会产生毒性很强的外毒素，进而引发鱼类出血性败血症[3]。该菌对水产养殖业造成巨大经济损失，严重阻碍了水产动物的健康发展，同时也对人类的生命健康构成威胁。

试验以鲫鱼为对象，探讨饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼抗氧化能力、免疫功能及肝、肠组织结构的影响，为地衣芽孢杆菌的进一步研究奠定基础，也为鲫鱼的健康养殖开辟新的思路。

1 材料

1.1 菌种和试验动物

地衣芽孢杆菌菌种、嗜水气单胞菌菌种由吉林农业大学动物科学技术学院水产实验室于-80 ℃保存。试验鲫鱼360 尾，平均体重为（51.5±0.5） g，购自长春市新立城水库，基础饲料配方及营养水平见表1，购自浙江澳华饲料有限公司。

表1 基础饲料配方及营养水平（干物质基础，%）

1.2 主要耗材

超氧化物歧化酶试剂盒、过氧化氢酶测定试剂盒、丙二醛测定试剂盒、补体C3 检测试剂盒、补体C4检测试剂盒、碱性磷酸酶测定试剂盒、免疫球蛋白M测定试剂盒和酸性磷酸酶测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

2 方法

2.1 菌种的活化与扩增

将地衣芽孢杆菌菌株接种于LB 液体培养基[pH（7.3±0.1）]中活化，37 ℃培养至对数生长期，将菌液倒入10 mL EP 管中，离心，离心后弃上清液，用无菌磷酸盐缓冲液洗涤3 次，并重悬于无菌生理盐水中，均匀喷洒在基础日粮饲料上，使饲料中地衣芽孢杆菌的含量达到108CFU/g，搅拌均匀后放入烘箱，37 ℃烘干即可，现做现用。

2.2 饲养管理

试验鲫鱼在80 L的玻璃缸中暂养14 d，选择健康鲫鱼360 尾，分为空白对照组（CK 组）、地衣芽孢杆菌试验组（DY 组）、嗜水气单胞菌攻毒组（CKG 组）和地衣芽孢杆菌治疗组（DYG 组），每组随机分配3 个重复，每个重复30 尾鱼。CK 组和CKG 组以基础饲料投喂，DY 组和DYG 组将地衣芽孢杆菌添加到基础饲料中投喂，每日10：00—10：30、16：00—16：30 进行投喂，按3%体重日粮饲喂，连续投喂6 周，2 d 换一次水，每次换水40 L。

2.3 生长指标检测

试验开始时，分别测定各组鲫鱼初始体重，饲喂6 周后，称重前停食24 h，空腹测定终末体重，计算各组试验鱼的相对增重率和特定生长率。

相对增重率（%）=（终末体重-初始体重）/初始体重×100

特定生长率（%/d）=（In 终末体重-In 初始体重）/饲养天数×100

2.4 样品采集

6 周投喂试验结束后，每个玻璃缸中随机选取9 尾鱼取样，使用MS-222（200 mg/L）麻醉，从尾静脉抽取血液，4 ℃静置24 h 用以制备血清。取肝、肠组织固定在固定液中用于制备组织学切片。石蜡切片的制作由塞维尔生物公司完成。然后通过腹腔注射嗜水气单胞菌的方式对剩余各组鲫鱼进行攻毒试验。每尾鱼经腹腔注射0.2 mL嗜水气单胞菌，将嗜水气单胞菌悬浮在1×PBS里，剂量为107CFU/mL。攻毒24 h后，从各组随机选择9 尾鱼，其余操作同上。攻毒期间观察鲫鱼的状态并及时记录死亡情况，14 d后结束感染试验并统计累积死亡率。

累积死亡率(%)=累积死亡数量/初始数量×100

2.5 数据统计分析

使用SPSS 20.0 软件对试验数据进行单因素方差分析，结果以“平均值±标准差”表示，采用Tukey 多重比较分析组间差异显著性，若P＜0.05 表示组间差异显著。

3 结果与分析

3.1 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼生长性能的影响

从表2 可知，与CK 组相比，DY 组可显著提高鲫鱼终末体重、相对增重率和特定生长率（P＜0.05）。

表2 地衣芽孢杆菌对鲫鱼生长性能的影响

3.2 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清免疫指标的影响

由图1可知，6周饲养试验结束后，与CK 组相比，DY 组显著提高鲫鱼血清中ACP活性和C3、C4、IgM 含量（P＜0.05），DY组AKP活性有升高趋势组不显著（P＞0.05）。但是攻毒后，受地衣芽孢杆菌的保护，与CKG组比，DYG 组鲫鱼血清中AKP、ACP 活性及C4 含量显著提高（P＜0.05），但C3和IgM含量差异不显著（P＞0.05）。

图1 地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清非特异性免疫指标的影响

3.3 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清抗氧化能力的影响

由图2可知，6周饲养试验结束后，DY组的鲫鱼血清中的CAT、SOD 活性显著高于CK 组（P＜0.05），MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）。攻毒后，与CKG 组相比，DYG组的SOD活性、MDA含量相比CKG组差异显著（P＜0.05），但CAT活性差异不显著（P＞0.05）。

图2 地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清抗氧化指标的影响

3.4 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼肠道组织结构的影响

由图3 和表3 可以看出，DY 组肠绒毛高度、宽度及肌肉厚度均高于对照组，CK 组和DY 组肠绒毛细胞结构完整，细长呈指状，形态较好。攻毒后,CKG 组肠道出现损伤，肠绒毛发生断裂，肠上皮细胞排列紊乱，纹状缘排列不规则，肠上皮细胞出现空泡化。DYG组较CKG 组的损伤较轻，纹状缘和上皮细胞排列整齐，细胞边界明显。

图3 地衣芽孢杆菌对鲫鱼肠道组织结构的影响

3.5 饲料中添加地衣芽孢杆菌对鲫鱼肝脏组织结构的影响

由图4 可知，经显微观察后，CK 组肝细胞排列紧密，边界清晰，细胞质致密，细胞核均居于细胞的中间，肝血窦清晰可见，结构完整，DY 组肝细胞与CK 组相差不大。CKG 组肝细胞核迁移，肝血窦充血，肝细胞出现损伤，肝细胞核溶解，排列紊乱，界限模糊，DYG 组的肝细胞较CKG 组情况有所好转，损伤减少，排列逐渐清晰，情况有所缓解。

图4 地衣芽孢杆菌对鲫鱼肝脏组织结构的影响

3.6 攻毒感染试验

含地衣芽孢杆菌饲料喂养鲫鱼6 周后，进行嗜水气单胞菌注射攻毒试验，感染期间累积死亡率的统计结果见图5。CKG 组第1 天即出现死亡情况，6 d 内死亡率急剧增加，接下来几天开始减缓，14 d 内的累积死亡率达83.33%；而DYG 组在第2 天出现死亡，死亡率显著低于CKG组（P＜0.05）。

图5 嗜水气单胞菌感染 14 d 内鲫鱼累积死亡率

4 讨论

水产养殖中益生菌的添加为鱼类的健康生长提供了一种生态友好的预防措施。芽孢杆菌作为一种重要的益生菌，在水产养殖中得到广泛应用。王旭达等[4]投喂仿刺参含有不同浓度地衣芽孢杆菌的饲料，试验结果表明投喂107CFU/g 和109CFU/g 地衣芽孢杆菌的仿刺参,不仅可以促进仿刺参的生长，显著提高消化酶活性及免疫酶活性，还可以增强其对灿烂弧菌的抵抗能力。Peng 等[5]发现，地衣芽孢杆菌T-1 的N-酰基高丝氨酸乳糖YtnP 对鲫鱼嗜水气单胞菌感染具有抑制作用，可以通过减弱毒力因子的表达，增强对感染嗜水气单胞菌的水生动物的保护作用，对嗜水气单胞菌感染的最佳保护期在感染早期，可用于水产养殖的早期预防。樊英等[6]在饲料中添加含活菌量达5×107CFU/g 和1×108CFU/g 的地衣芽孢杆菌投喂大泷六线鱼，研究发现两种饲料对大泷六线鱼生长指标、肠道消化酶活性和非特异性免疫酶活性均有显著提高。由于添加剂量不同，提高程度也有所不同。所以地衣芽孢杆菌对水产养殖具有积极作用，能够促进水产动物健康发展，并且具有作为水产养殖疾病预防和控制的生物防治剂的潜力。

4.1 地衣芽孢杆菌对鲫鱼生长性能的影响

在饲料中添加地衣芽孢杆菌可以促进动物生长。研究报道，添加地衣芽孢杆菌可以显著提高草鱼（Ctenopharyngodon idella）、罗非鱼（Oreochromis spp）、肉鸡、肉兔、断奶仔猪等的生长性能。王佳昕等[7]研究发现饲粮中添加地衣芽孢杆菌可以提高肉鸡的生长性能，添加量为1.0×109CFU/kg 效果最佳。Elleithy等[8]研究发现在肉鸡日粮中添加多种芽孢杆菌菌株显著增加了体重。Qin 等[9]研究发现饲粮中添加地衣芽孢杆菌可以提高草鱼的生长性能，可能是由于地衣芽孢杆菌分泌的消化酶，提高了饲料的消化和吸收。以上试验结果与本试验一致，因此饲料中添加适量的地衣芽孢杆菌可以提高鱼的生长性能。

4.2 地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清免疫指标的影响

AKP作为一种重要的生物体内的代谢调节酶，参与动物免疫反应，能抵抗致病菌，杀死微生物和异物，加速物质的吸收和运输。AKP 和ACP 相互联系，ACP是调控磷代谢的重要酶。补体是一种存在于脊椎动物血清和组织液中的多蛋白组分系统。激活后，它可以介导免疫反应和炎症反应，导致病原微生物溶解或吞噬。IgM 具有杀菌、激活补体、免疫调节和凝集功能，并参与某些自身免疫性疾病和超敏反应的病理过程，在先天免疫反应中起关键作用[10]。胡娟等[11]研究发现枯草芽孢杆菌HGcc-1 通过激活补体系统，增强鲤鱼的非特异性免疫。Han 等[12]研究发现地衣芽孢杆菌能够增加罗非鱼幼鱼血清中补体C3 含量，提高溶菌酶的活性，添加的最佳浓度为4.4×106CFU/g。地衣芽孢杆菌不仅能够促进罗非鱼幼鱼的生长，提高抗病性，还能促进前肠的发育，保持其完整性。Zhang 等[13]研究显示饲喂1×107CFU/g 地衣芽孢杆菌和0.3%低聚果糖时三角鲷血清中的IgM 含量显著增加。低聚果糖和地衣芽孢杆菌相互作用会更好地发挥作用，能显著增强三角鲷的先天免疫、抗氧化能力并提高抗病性。以上研究结果与本试验结果相似。本试验中，DY 组鲫鱼血清中AKP 活性有升高趋势但并不显著，攻毒后DYG 组中鲫鱼血清中C3 和IgM 含量较CKG 组差异不显著，可能是个体差异的原因。因此地衣芽孢杆菌对鱼体的免疫机能具有积极作用。

4.3 地衣芽孢杆菌对鲫鱼血清抗氧化能力的影响

SOD 和CAT 是鱼体的抗氧化酶中的重要组成部分，可以保护鱼类免受氧化损伤，SOD 被认为是抵御氧化应激的第一道防线，能够消除有害自由基以及减少氧化应激发生[14]；CAT 是防止活性氧对细胞产生负面影响的主要抗氧化酶，可催化过氧化氢分解为水和氧[15]。MDA是脂质过氧化的主要产物，已被用作各种生物体氧化应激的指标[16]，所以可以根据这些指标来评价鱼体的抗氧化能力。高肖微等[17]的研究结果表明，饲料中添加地衣芽孢杆菌能够显著提高鲤鱼SOD和CAT 的活性，说明在饲料里添加地衣芽孢杆菌，有利于提高鲤鱼抗氧化能力，增强鱼体免疫力，这与本研究结果相似。巴翠玉等[18]发现将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌进行组合可以提高鲫鱼抗氧化酶活性和非酶抗氧化物质GSH 和T-AOC 的含量，降低MDA 的含量。以上结果均显示，地衣芽孢杆菌有助于保护鱼类免受氧化应激，提高鱼体抗氧化能力。

4.4 地衣芽孢杆菌对鲫鱼肠、肝组织结构的影响

鱼类肠道由黏膜层、黏膜下肌层和浆膜层四部分组成，是鱼类消化和吸收功能的主要器官，对鱼体的健康起着至关重要的作用[19]。Qin 等[9]研究发现在草鱼的日粮中添加105CFU/g 和106CFU/g 地衣芽孢杆菌，绒毛高度和肌肉厚度显著增加，因为地衣芽孢杆菌分泌的消化酶能够促进肠道绒毛的增加，提高饲料利用率。Zhang 等[20]在鲤鱼的养殖中，将地衣芽孢杆菌作为饲料添加剂，各试验组鲤鱼肠道绒毛显著高于对照组，表明其促进了肠绒毛的发育。邱燕等[21]在饲料中添加枯草芽孢杆菌投喂草鱼，结果显示微绒毛宽度和密度均显著提高，说明枯草芽孢杆菌能够促进草鱼肠道微绒毛的生长发育，从而增加肠道的吸收面积，提高了饲料的消化率和吸收率。以上结果与本试验一致，均表明地衣芽孢杆菌可以提高肠绒毛的长度，在改善鱼类肠道健康方面发挥重要的作用。肝脏是鱼类主要的代谢和解毒器官[22]。在其他的动物模型中，地衣芽孢杆菌已被证明对肝损伤具有保护作用，如Zhao 等[23]研究在膳食中添加地衣芽孢杆菌提高肉鸡的生长性能、小肠和肝脏的形态以及对产气荚膜梭菌诱导的亚临床坏死性肠炎的抗氧化能力中，亚临床坏死性肠炎感染组的肝细胞严重肿胀，脂肪变性，饲喂地衣芽孢杆菌组的肝脏只有轻微的充血和细胞变性，得到了明显的改善。与本研究结果一致，说明在饲料中添加地衣芽孢杆菌能够预防肝损伤。

4.5 地衣芽孢杆菌对鲫鱼抵抗嗜水气单胞菌感染的影响

嗜水气单胞菌作为引起水产动物病害的主要病原菌，给水产养殖带来了极大的困扰[24]。通过腹腔注射的攻毒方式使试验动物感染病原体，能够清晰明确的看到试验动物的状态，从而直面的反映益生菌制剂的保护作用[25]。本试验经过嗜水气单胞菌攻毒发现，日粮中添加地衣芽孢杆菌能够有效提高鲫鱼的抗病能力，降低鲫鱼的累积死亡率。Chen 等[26]研究发现地衣芽孢杆菌T-1 是一种安全的群体猝灭细菌、是一种潜在的益生菌。地衣芽孢杆菌T-1 显著降低了感染嗜水气单胞菌的斑马鱼的死亡率，并将存活率提高到70%。Gobi 等[27]发现将浓度为107CFU/g 的地衣芽孢杆菌应用至日粮中，结果显示喂食地衣芽孢杆菌的鱼类的累积死亡率显著低于喂食对照饲料的鱼类，表明其可以改善罗非鱼养殖的健康状况和对嗜水气单胞菌的抗性。同本试验结果相似。以上结果均表明，地衣芽孢杆菌可以提高水产动物对嗜水气单胞菌的抗性，但具体的机制还有待进一步研究。