不同产地冬虫夏草中微量元素分析

王维恩

青海师范大学化学化工学院,青海 西宁 810008

引 言

冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis.)是青藏高原特有种,主产于青海、西藏、云南、四川、贵州等海拔3 300～4 500 m的山地阴坡或半阴半阳坡的高山草间和灌木丛林地,冬虫夏草药材是由隶属于真菌界、真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、肉座菌目、线虫草科、线虫草属的药用真菌冬虫夏草菌的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆虫幼虫尸体的复合体组成[1-4]。冬虫夏草味甘,性温,效润而柔。归肺、肾经。是温和滋补的上等补药,中医、藏医上多用于干燥的子实体及虫体入药,具有滋肺和补肾之功效。用于阳痿遗精、腰膝酸痛、久咳虚喘、劳嗽痰血、病后体虚或自汗畏寒等症。现代药理学研究表明,冬虫夏草具有双向免疫调节、抗应激、抗惊厥、抗炎症、降血压、降血脂、降血糖、抗肾功能衰竭、抗氧化、抗癌和抗衰老、脏器保护作用等多种功效[5-7]。

必须微量元素维持着生物组织的正常生命活动,这些元素的存在能够使生物生理或结构的不正常现象消失或预防不正常现象的产生,甚至与疾病的治愈密切相关,一些非必须微量元素的过量摄入又会对生物机体产生危害。中药的归经、性味、功能、主治与中药中的某些微量元素相关,冬虫夏草作为一味药食同源的珍贵药材,研究其中微量元素的含量及分布特征,探讨其优势微量元素与冬虫夏草功效之间的关系,具有一定的科学价值。针对多区域冬虫夏草中重要微量元素分布特征研究的文献较少,本文研究了15个产地冬虫夏草中的微量元素铁(Fe)、铜(Cu)、锰(Mn)、锌(Zn)、硒(Se)、锶(Sr)和重金属元素砷(As)、铅(Pb)含量的区域动态,分析了必须微量元素的分布特征,为冬虫夏草的品质评价和功效研究提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 冬虫夏草主产区概况

冬虫夏草的主产区在青藏高原,其中80%的冬虫夏草来自青海,青海省玉树州、果洛州和黄南州南部各地所产冬虫夏草又占到很大比例,这些地区属于高原亚寒带季风气候。冬虫夏草采集时间在5月下旬至6月下旬,期间月平均气温12 ℃,最低气温5.6 ℃,最高气温16 ℃,80%～95%湿度是最适于冬虫夏草生长的。以果洛州达日地区的年降水量为例,全年60%以上的降水出现在夏季,年均降雨量542.2 mm[8]。

1.2 材料

冬虫夏草收自各地虫草采挖交易市场新鲜全草,200目硅胶干燥后花椒防腐保存,分别编号为:S1(祁连)、S2(河卡)、S3(玛沁)、S4(阿坝)、S5(达日)、S6(甘德)、S7(称多)、S8(杂多)、S9(治多)、S10(那曲)、S11(合作)、S12(碌曲)、S13(松潘)、S14(同仁)、S15(迪庆),由青海师范大学王维恩副教授鉴定为Ophiocordycepssinensis.。

1.3 仪器和工作参数

Agilent 725-ES ICP-OES光谱仪(Agilent Technologies Co. Ltd,USA);AA240Z石墨炉原子吸收光谱仪(Agilent Technologies Co. Ltd,USA);AFS-933原子荧光光谱仪(北京吉天仪器公司);ME204E电子天平(Mettler Tolrdo,USA);Lab Tech REVO 微波消解仪(北京莱伯泰科仪器股份有限公司);SZ-93A自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);KQ-250DV型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);万能高速粉碎机(上海比朗仪器有限公司)。

ICP-OES光谱仪工作参数:RF入射功率1 300 W,等离子气流量15 L·min-1,辅助气流量14 L·min-1,雾化气流量0.5 L·min-1,观测高度为15.0 mm,进样流速1.5 mL·min-1。

石墨炉原子吸收光谱仪分析铅元素工作参数:空心阴极灯波长283.8 nm,狭缝宽度0.7 mm,热解石墨管,干燥温度170 ℃,灰化温度700 ℃,原子化温度1 700 ℃,清除温度2 450 ℃,氩气流量250 mL·min-1,硝酸钯为化学改进剂。

原子荧光光谱仪分析砷元素工作参数:空心阴极灯波长220.3 nm,原子化器高度8 mm,光电倍增管负高压270 V,屏蔽气流量1 L·min-1;载气流量500 mL·min-1。

1.4 试剂和溶液

标准储备液:1 000 μg·mL-1环境混合标准溶液(5%硝酸介质)(environmental calibration standard,Agilent),内含Zn、Mn、Cu、Fe等元素;1 000 μg·mL-1的Pb标准溶液(北京普天同创生物科技有限公司);100 μg·mL-1的Sr标准溶液(北京普天同创生物科技有限公司);100 μg·mL-1的As标准溶液(北京普天同创生物科技有限公司);10 μg·mL-1的Se标准溶液(北京普天同创生物科技有限公司)。优级纯硝酸(15 mmol·L-1北京化工厂);分析纯过氧化氢(30%中国四川成都金山化工试剂厂);分析纯硼氢化钾(95%南京化学试剂有限公司);分析纯氢氧化钾(天津市永大化学试剂有限公司)。

1.5 标准曲线

1.5.1 ICP-OES光谱标准曲线

2%硝酸介质将混合标准溶液逐级稀释为5、10、20、30、40、50和100 μg·mL-1,得到混合标准溶液的一系列浓度。在优化的实验条件下,采集空白及标准溶液系列,仪器自动绘制标准曲线。2%硝酸介质将100 μg·mL-1的Sr标准溶液稀释为1、5、10、20和50 μg·mL-1,得到Sr标准溶液的一系列浓度,导入仪器进行测定,制作校准曲线。

1.5.2 石墨炉原子吸收光谱标准曲线

2%硝酸介质将1 000 μg·mL-1的Pb标准溶液稀释为1、5、10、20、50和100 μg·mL-1,得到Pb标准溶液的一系列浓度,采集空白及标准溶液系列,制作校准曲线。

1.5.3 原子荧光光谱标准曲线

5%盐酸介质将100 μg·mL-1的As标准工作液稀释为0.01、0.05、0.10、0.20和0.40 μg·mL-1,得到As标准溶液的一系列浓度,采集空白及标准溶液系列。分取Se标准工作液(0.1 mg·L-1) 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、10.0 mL至100 mL容量瓶中用铁盐溶液稀释至刻度。工作曲线的浓度分别为0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00和10.00 μg·L-1。按仪器条件调整好仪器然后用注射器分取2 mL标准溶液注入氢化物发生器中,按下加液磁阀加入0.7%KBH4,从读数显示屏上读取荧光强度的数值。依次测定工作曲线各点的荧光强度,以工作曲线的浓度为横坐标以荧光强度为纵坐标做标准曲线。

1.5.4 标准曲线的线性方程与精密度

通过各元素标准曲线的绘制,得到相应的线性方程和精密度,如表1所示。

表1 8种元素测定的线性方程及精密度Table 1 Linear equations and precision of determination of eight elements

1.6 样品处理

15个产地冬虫夏草样品分别用体积分数75%的乙醇溶液超声波清洗5 min,再用吸水纸吸干,鼓风干燥箱内60 ℃干燥6 h后取出冬虫夏草。干燥的冬虫夏草粉碎,过40目筛,精确称取0.5 g样品,放置于聚四氟乙烯消解罐中,加入4 mL HNO3和0.5 mL H2O2,密闭消解罐,按照140 ℃消解15 min,保温3 min,在升温至190 ℃消解15 min,保温20 min,最后冷却30 min的程序消解。消解结束后,冷却至常温,将样品液转移至25 mL容量瓶中,用少量超纯水洗涤消解罐3次,洗液合并入容量瓶,定容至刻度。

2 结果与讨论

2.1 不同产地冬虫夏草观测元素含量测定结果

对15个产地3批冬虫夏草样品中的8种微量元素进行了测定,分别测算出不同产区的冬虫夏草样品中8种微量元素含量的平均值,结果见表2。

表2 不同产地冬虫夏草中观测元素含量的平均值(n=3;μg·g-1)Table 2 Mean elemental concentrations of observed elements in Ophiocordyceps sinensis. from different habitats(n=3;μg·g-1)

2.2 不同产地冬虫夏草观测元素含量测定结果分析

对冬虫夏草观测元素的分析结果表明,相对具有适应原样作用的香菇和淫羊藿作为参照,冬虫夏草所含Mn、Fe、Zn、Se均在较高水平,Mn的平均含量及范围在60.4 μg·g-1(48.5～84.1 μg·g-1),Fe的平均含量及范围在1 770.5 μg·g-1(301.9～3 089.8 μg·g-1),Zn的平均含量及范围在106.2 μg·g-1(76.18～163.0 μg·g-1),Se的平均含量及范围在0.055 μg·g-1(0.021～0.083 μg·g-1)。玛沁冬虫

夏草Mn和Fe含量最高,分别达到了84.1和3 089.8 μg·g-1。祁连、合作、碌曲、松潘、阿坝一线冬虫夏草含Zn量显著较高,其中青海祁连冬虫夏草的Zn含量最高,达到了163 μg·g-1,冬虫夏草Zn的平均含量是淫羊藿中Zn含量的6倍多。这些元素在冬虫夏草补肾益肺、止血化痰的功效方面起着重要的辅助作用[9-10],冬虫夏草补肾壮阳之功与其较高含量的锌和锰有关,润肺平喘的功效与其高水平的Zn含量和高达30.6的Fe/Mn值有关。Cu的平均含量在17.4 μg·g-1,Sr的平均含量在4.4 μg·g-1。Pb的平均含量在2.33 μg·g-1,只有同仁的冬虫夏草Pb含量略有超标,As的平均含量在11.42 μg·g-1,超出了2010版中国药典限量的5倍多,其中以青海同仁、四川阿坝、四川松潘、青海达日、青海祁连、甘肃合作六地的冬虫夏草As含量分别为:21.63、18.6、13.90、13.88、13.42和13.40 μg·g-1。如图1所示:不同产地冬虫夏草中Fe、Mn、As、Zn平均含量的分布情况。如图2所示:冬虫夏草中As、Zn、Mn、Cu、Sr、Pb、Se元素的箱线图统计结果。

图1 不同产地冬虫夏草中Fe、Mn、As、Zn元素平均含量分布Fig.1 Average content of Fe,Mn,As,Zn in Ophiocordyceps sinensis from different habitats

图2 冬虫夏草中As、Zn、Mn、Cu、Sr、Pb、Se元素平均含量的描述性统计Fig.2 Descriptive statistics the average contents of As,Zn,Mn,Cu,Sr,Pb and Se in Ophiocordyceps sinensis

依据图1的元素平均含量的分布情况和图2的箱线图可知:冬虫夏草中Fe元素含量呈右偏态分布,上四分位数为2 173.1 μg·g-1,下四分位数为1 151.6 μg·g-1。Mn 元素含量呈左偏态分布,上四分位数为68.4 μg·g-1,下四分位数为52.8 μg·g-1。Zn元素含量呈标准正态分布,上四分位数为126.1 μg·g-1,下四分位数为79.29 μg·g-1。As 元素含量呈左偏态分布,上四分位数为13.88 μg·g-1,下四分位数为8.29 μg·g-1。Cu元素含量呈标准正态分布,上四分位数为17.8 μg·g-1,下四分位数为16.2 μg·g-1,异常值祁连23.0 μg·g-1和治多20.5 μg·g-1拉高了平均值。Sr元素含量呈左偏态分布,上四分位数为4.88 μg·g-1,下四分位数为3.85 μg·g-1,异常值玛沁6.83 μg·g-1拉高了平均值。Pb元素含量呈左偏态分布,上四分位数为2.89 μg·g-1,下四分位数为1.52 μg·g-1,异常值同仁5.48 μg·g-1拉高了平均值。Se元素含量呈右偏态分布,上四分位数为0.073 μg·g-1,下四分位数为0.035 μg·g-1。冬虫夏草中8种被观测元素的平均含量分布基本反映了冬虫夏草微量元素的本底值分布特征,统计分析表明:冬虫夏草中8种被观测元素的平均含量的文献值在本论文分析的上四分位数和下四分位数范围内,其中冬虫夏草中Fe、Mn、As、Zn的平均含量呈现显著的地区差异。

3 结 论

通过不同方法分析了15个产地冬虫夏草中观测元素Fe、As、Zn、Mn、Cu、Sr、Pb、Se的平均含量,结果表明:ICP-OES光谱仪分析Fe、Zn、Mn、Cu、Sr可排除Ca、Mg、S、P等共有元素的干扰,其稳定性和可靠性都优于ICP-MS[11]。石墨炉原子吸收光谱分析Pb元素含量,分析结果的稳定性和可靠性较好。与补肾要药淫羊藿相比,冬虫夏草中所含Fe、Mn、Zn、Se均在较高水平,冬虫夏草中必须微量元素的平均水平可作为冬虫夏草品质评价的科学依据。冬虫夏草补肾壮阳之功与其较高含量的锌和锰有关,润肺平喘的功效与其高水平的Zn含量和高达30.6的Fe/Mn值有关,这一论断有待细胞药理学和分子药理学层面的深入研究。

冬虫夏草中Pb的平均含量在中国药典的限量以内,As的平均含量超出了药典限量5倍之多,关于冬虫夏草中As的平均含量超标的安全评价问题颇有争议,这是因为冬虫夏草中的As元素存在的化学状态、进入人体后在肠道和血液循环过程中的运动变化都不甚清楚。据文献报道,世界卫生组织建议无机砷周摄入最大限量是15 μg·kg-1·BW,即以中国成年男性平均体重60 kg估算(成年女性平均体重57.3,成年男性平均体重66.2 kg),每日摄入9克冬虫夏草,冬虫夏草平均含砷量日摄入11.4 μg·g-1计算,砷周摄入量为1.71 μg·kg-1·BW,是在安全范围,若考虑到砷在体内蓄积的问题,以上服用量不超过2个月,THQ指数小于1,即对人体健康不产生危害[12]。

冬虫夏草中的各种观测微量元素存在的化学状态、进入人体后在肠道和血液循环过程中的运动变化规律,需要研究冬虫夏草标志性成分与这些微量元素之间的协同作用路径和方式,基于动物药理学、细胞药理学和网络药理学研究预测活性组分-靶点网络的工作是非常必要的。