直肠癌组织中miR-128-3p、TUFT1表达与患者临床病理特征及预后的关系

杨文彬，蒋宗霖，张坚，马琳

1 青岛市第八人民医院肛肠外科，山东青岛266100；2 青岛大学附属医院（平度）胃肠外科

结直肠癌是胃肠道常见恶性肿瘤。近年来随着生活习惯的改变和人口平均寿命的延长，结直肠癌发病率呈持续上升趋势，据流行病学统计，2022年我国新发结直肠癌病例592 232例，死亡309 114例［1］。尽管近年来直肠癌的诊治取得一定进展，但患者预后仍然较差［2-3］，因此探索直肠癌发病机制对预后改善至关重要。研究表明，微小RNA（miRNA）等非编码RNA作为独特的RNA转录本，参与直肠癌细胞各种行为调控［4］。miR-128-3p与口腔鳞状细胞癌、结肠癌等恶性肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移有关［5-6］。釉丛蛋白1（TUFT1）是一种酸性蛋白，能通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路促进肿瘤细胞恶性行为进展［7］。目前关于miR-128-3p、TUFT1与直肠癌关系的报道较少，本研究拟探讨直肠癌组织中miR-128-3p、TUFT1表达与患者临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年7月—2020年1月青岛市第八人民医院收治的102例直肠癌患者，男58例、女44例；年龄34～81（60.42 ± 5.83）岁；肿瘤直径≥4 cm 66例、<4 cm 36例；肿瘤分化程度为低分化66例、中高分化36例；TNM分期［8］Ⅰ～Ⅱ期44例、Ⅲ期58例；淋巴结转移50例。纳入标准：经病理检查确诊为直肠癌；患者及家属签署知情同意书；行姑息或根治性手术。排除标准：非初次确诊或已接受抗肿瘤治疗；合并其他部位恶性肿瘤；年龄<18岁；合并急慢性感染；合并免疫、血液、神经系统损害；院内死亡、拒绝随访、失访、临床资料不完整。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达检测 术中收集患者癌组织及其癌旁组织（距离癌组织>3 cm并经病理检查证实为正常组织），液氮下研磨组织标本，TRIzol法（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）提取组织总RNA，TaKaRa RNA PCR Kit试剂盒（北京麦瑞博生物科技有限公司）逆转录合成cDNA，条件42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA为模板，参考SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒（北京智杰方远科技有限公司）说明书，用实时荧光定量PCR分析仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］进行扩增，反应体系共20.0 µL：cDNA模板1.0 µL、2×Master mix 8 µL、上游引物0.5 µL、下游引物0.5 µL、SYBR Premix Ex Taq 5.0 µL、RNase-free ddH25.0 µL；反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s循环40次。miR-128-3p、TUFT1分别以U6、GAPDH为内参校正，2-ΔΔCT法计算组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA相对表达量。miR-128-3p上游引物序列5′-CAGCATCACTGGCCAAGGAGCTGA-3′，下游引物序列5′-GACCACACTGATGACTCCTGTGTTCC-3′；TUFT1上游引物序列5′-AAAGGACGCCACCATCCAG-3′，下游引物序列5′-GTGCTGAAGTTGCCATGACTG-3′；U6上游引物序列5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物序列5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；GAPDH上游引物序列5′-AACGGGAAGCTCACTGGCATG-3′，下游引物序列5′-TCCACCACTGTTGCTGTAG-3′。

1.3 随访 出院后通过电话或门诊随访直肠癌患者3年，第1年3个月1次，以后6个月1次。随访至患者死亡或2023年1月。根据直肠癌组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达均值将患者分为高、低表达组，比较累积生存率。

1.4 统计学方法 采用SPSS28.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以表示，两组比较采用t检验；Pearson相关法分析直肠癌组织中miR-128-3p与TUFT1 m RNA的关系；用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，累积生存率比较采用Log-rank方法；直肠癌患者死亡的影响因素采用多因素Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直肠癌组织、癌旁组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达比较 与癌旁组织比较，直肠癌组织中miR-128-3p表达低，TUFT1 mRNA表达高（P均<0.05）。见表1。

表1 直肠癌组织、癌旁组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达比较（）

表1 直肠癌组织、癌旁组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达比较（）

组别癌组织癌旁组织P miR-128-3p 0.867 ± 0.187 1.463 ± 0.324<0.05 TUFT1 mRNA 1.776 ± 0.469 1.052 ± 0.267<0.05

2.2 直肠癌组织中miR-128-3p与TUFT1 mRNA表达的相关性 Pearson相关分析显示，直肠癌组织中miR-128-3p与TUFT1 mRNA表达呈负相关（r=-0.752，P<0.05）。

2.3 直肠癌组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 直肠癌组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关（P均<0.05），与患者性别、年龄、肿瘤最大径无关（P均>0.05）。见表2。

表2 直肠癌组织中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

2.4 miR-128-3p、TUFT1 mRNA表达与直肠癌患者预后的关系 102例直肠癌患者随访3年，死亡30例，累积生存率为70.59%（72/102）。miR-128-3p高、低表达组3年累积生存率分别为84.91%（45/53）、55.10%（27/49），比较差异有统计学意义（P<0.05）；TUFT1 mRNA高、低表达组3年累积生存率分别为56.86%（29/51）、84.31%（43/51），比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.5 直肠癌患者死亡的影响因素 排除失访3例患者，根据直肠癌患者存活状况分为死亡组与存活组，将表3单因素分析有差异因素作为自变量，随访时间为时间变量，生存状态（赋值：死亡为“1”；存活为“0”）为因变量，多因素Cox回归模型分析显示，直肠癌患者死亡的独立危险因素为低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴结转移、TUFT1 mRNA高表达，独立保护因素为miR-128-3p高表达（P均<0.05）。见表4。

表3 影响直肠癌患者死亡的单因素分析

表4 影响直肠癌患者死亡的多因素Cox回归分析

3 讨论

直肠癌是起源于直肠黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，以便血、大便习惯改变、肠道狭窄或梗阻等为主要临床表现，尽早诊断和切除直肠癌病灶是降低患者病死率的有效措施，但由于直肠癌早期症状并不典型，导致我国大多患者在初诊时处于中晚期，Ⅰ期诊断率仅13.9%［9］。目前，手术仍然是直肠癌早期最有效的治疗措施，尽管近年来免疫和靶向治疗取得长足进展［10］，但晚期直肠癌极易发生肝、脑、腹膜等部位转移，且随着免疫和靶向治疗时间的延长，获得性耐药和不良反应也越来越多，导致直肠癌患者预后仍然不容乐观［11-13］。

直肠癌的发生、发展是多因素、多基因、多步骤参与的复杂过程，miRNA作为一类新兴表观遗传调控分子，能通过与mRNA完美互补或不完美配对引发mRNA降解或转录后基因沉默，作为促癌或抑癌基因参与直肠癌的发生、发展［14］。miR-128-3p定位于人染色体2q21.3，徐玉红等［15］研究报道，miR-128-3p能靶向下调锌指E盒同源结合蛋白1表达，抑制卵巢癌细胞上皮-间充质转化。miR-128-3p能靶向下调GATA结合蛋白2表达，以抑制Ras同源家族成员A信号通路，进而抑制肺癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化［16］；能靶向下调具有CCCH锌指结构域的蛋白质12D表达，促进骨肉瘤细胞增殖、侵袭和抑制凋亡［17］。上述研究表明，miR-128-3p在不同类型肿瘤中发挥促癌或抑癌基因作用，但关于其与直肠癌的关系尚不清楚。本研究结果显示，直肠癌组织中miR-128-3p低表达，与分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关，说明miR-128-3p低表达与直肠癌发生、发展有关。miR-128-3p在直肠癌中低表达可能与其启动子被甲基化而表达沉默有关［18］。随着miR-128-3p表达降低，能上调叉头箱蛋白O4表达，激活转化生子因子-β/母亲对抗十肢瘫痪同源基因和Janus激酶/信号转导和转录激活因子3信号通路，促进直肠癌细胞上皮间质转化，进而促进其恶性进展［19］。

PI3K/AKT信号通路是由受体酪氨酸激酶激活导致PI3K复合物活性增加，将磷脂酰肌醇4，5-二磷酸转化为磷脂酰肌-3，4，5-三磷酸并激活AKT，是直肠癌中常被激活的一条信号通路，能促进直肠癌细胞增殖、分化、迁移、侵袭、血管生成，并增强直肠癌细胞对放化疗免疫治疗、靶向治疗的耐药性［20-21］。TUFT1是成釉细胞合成并分泌到牙釉质基质中的一种酸性蛋白质。研究发现，TUFT1参与釉质矿化，还能增强AKT磷酸化，激活PI3K/AKT信号通路，在肿瘤发生、发展中发挥重要作用［7］。LIN等［22］研究报道，TUFT1表达上调能激活PI3K/AKT信号通路，促进肾细胞癌细胞增殖和迁移，使用PI3K抑制剂抑制AKT磷酸化能减弱TUFT1的促癌作用。DOU等［23］研究报道，TUFT1表达上调能激活PI3K/AKT信号通路，促进肝细胞癌的生长和转移，敲低TUFT1能阻断其促癌作用。本研究结果显示，直肠癌组织中TUFT1 mRNA高表达，与患者病理特征有关，说明TUFT1 mRNA高表达参与直肠癌发生、发展。TUFT1 mRNA在直肠癌中高表达可能与其启动子被癌基因激活有关，随着TUFT1 mRNA表达上调能激活PI3K/AKT信号通路，促进直肠癌恶性进展。YANG等［24］实验也证实，TUFT1能激活PI3K/AKT信号通路，促进直肠癌细胞迁移和侵袭，并增强其耐药性。

本研究发现，miR-128-3p与TUFT1直肠癌组织中表达呈负相关，说明miR-128-3p和TUFT1可能共同参与直肠癌发生、发展。有研究发现，miR-128-3p能靶向下调TUFT1表达，抑制胃癌细胞增殖，促进其凋亡［25］。但关于miR-128-3p和TUFT1是否共同参与直肠癌进展还需进一步实验证实。本研究结果显示，高miR-128-3p表达和低TUFT1 mRNA表达的直肠癌患者3年累积生存率明显升高，二者均是直肠癌患者死亡的独立影响因子，说明直肠癌组织中miR-128-3p低表达和TUFT1 mRNA高表达还与患者预后有关，可能成为直肠癌诊治的新靶点。

综上所述，直肠癌组织中miR-128-3p低表达、而TUFT1高表达，与直肠癌的发生、发展有关。但本研究结果还需多中心研究证实。