LncRNA SNHG10对脂多糖诱导血管内皮细胞氧化应激损伤的影响

修晟尧，郭楠，凌书策，肖珉，常佩芬

1 北京中医药大学东直门医院心血管科，北京100010；2 北京中医药大学东直门医院ICU

近年来，由于人口老龄化和城镇化进程的快速发展，中国心血管疾病患病人数和发病人数逐年增加，2016年心血管疾病病死率位居第一，其中心血管疾病患病人数约有2.9亿［1］。血管内皮细胞是维持血管动态平衡的主要因素，参与肿瘤细胞增殖、凋亡、炎症反应和氧化应激等［2-4］，血管内皮功能紊乱易造成多种疾病的发生，如动脉粥样硬化、高血压等［5］。研究发现，脂多糖（LPS）可诱导人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞血管的生成和转移，促进其凋亡和炎症反应［6-7］。因此，本研究以LPS诱导HUVEC细胞，构建体外细胞模型。研究显示，长链非编码RNA（lncRNAs）在多种心血管疾病中异常表达［8］，参与心血管疾病的细胞增殖、凋亡、转移和氧化应激等病理过程［9-10］。研究发现，下调MALAT1可抑制HUVEC增殖［11］。CHEN等［12］研究发现，lncRNA HULC在LPS刺激HUVEC后表达上调，下调HULC可促进LPS对细胞的活性，抑制细胞凋亡、炎症反应和氧化应激。XING等［13］研究表明，通过对MIAT和miR-330-5p在LPS诱导的败血症性心肌病的炎症反应和氧化应激中发现，MIAT、miR-330-5p表达均上调，干扰MIAT或过表达miR-330-5p可明显抑制LPS诱导的败血症性心肌病炎症反应和氧化应激。小核仁RNA宿主基因10（SNHG10）在胃癌、非小细胞肺癌和胰腺癌等疾病中表达上调，参与细胞的增殖、凋亡和侵袭等［14-16］。2020年1月—2022年12月，我们以HUVEC为研究对象构建体外模型，探讨SNHG10对LPS诱导的血管内皮细胞活力、凋亡、炎症反应和氧化应激的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 LPS购自Sigma公司；HUVEC购自北京协和细胞资源中心；LipofectamineTM2000试剂盒、TRIzol试剂盒、Prime Script RT反转录试剂盒和SYBR Green Master Mix试剂盒购自美国Invitrogen公司；胎牛血清购自美国Gibco公司、DMEM高糖培养基、CCK-8试剂盒、DMSO溶液及质粒（si-NC、si-SNHG10）由北京索莱宝科技有限公司合成纯化；Buffer溶液、Annexin V-FITC和PI购自北京碧云天生物技术有限公司；Ki-67抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体和GAPDH抗体购自博奥森生物技术有限公司；TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒、IL-1β试剂盒、MDA试剂盒和SOD试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 细胞培养 人脐静脉内皮细胞HUVEC在含10 %胎牛血清的DMEM高糖培养基中，在培养箱中37 ℃、5% CO2条件下培养，每2天换1次培养基。

1.3 LPS合适浓度筛选 取对数生长期的HUVEC，加入胰酶消化重悬细胞，然后接种到96孔板内，每孔1×105个，常规培养24 h。待细胞生长融合至70%~80%时，用0、50、100、500 ng/mL的LPS处理细胞。TRIzol试剂盒提取细胞的总RNA，测定其含量，反转录合成cDNA，以cDNA为模板按照SYBR Green Master Mix试剂盒扩增PCR。以18S rRNA为对照，采用2-ΔΔCt法计算HUVEC细胞中SNHG10相对表达量。根据SNHG10相对表达量选取LPS最适浓度为500 ng/mL进行后续实验。

1.4 细胞转染与分组 取对数生长期的HUVEC，加入胰酶消化重悬细胞，然后接种到24孔内，每孔1×105个，常规培养24 h。待细胞生长融合至70%~80%时，分别将si-NC、si-SNHG10质粒转染至HUVEC细胞后加入浓度为500 ng/mL LPS处理（分别记为LPS+si-NC组、LPS+si-SNHG10组），选择未行任何处理的细胞为Control组，仅加入500 ng/mL LPS处理的细胞为LPS组，在培养箱内继续培养48 h，收集对数生长期细胞。

1.5 各组细胞活力和凋亡率检测 采用CCK-8法。取各组细胞加入20 µL的CCK-8试剂，培养箱中培养4 h，在酶标仪450 nm波长下检测细胞吸光度值。流式细胞仪检测细胞凋亡率：取各组细胞加入胰酶消化细胞，接种到6孔板，每孔1×105个。加入Buffer溶液重悬细胞，然后每孔内依次加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL PI，混匀后避光反应15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 各组HUVEC中SNHG10 mRNA相对表达量检测 采用RT-qPCR法。取各组HUVEC，TRIzol试剂盒提取各组细胞的总RNA，测定其含量，反转录为cDNA，以cDNA为模板按照SYBR Green Master Mix试剂盒扩增PCR。SNHG10正向引物：5′-GTTGGTCTCTTGGGAGGTAG-3′，反向引物：5′-CGCCACGACGAACTGCATGC-3′；18S rRNA正向引物：5′-CTACCACATCCAAGGAAGC-3′，反向引物：5′-TTTTCGTCACTACCTCCCC-3′。以18S rRNA作为内部对照，采用2-ΔΔCt法计算SNHG10 mRNA相对表达量。

1.7 各组Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表达检测 采用Western blotting法。取各组HUVEC，加入RIPA蛋白裂解液，冰浴裂解细胞，离心收集上清，在SDS-PAGE电泳处理后转PVDF膜内，加入脱脂牛奶封闭孵育1 h，加入Ki-67抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体和GAPDH抗体，4 ℃孵育，TBST洗涤，加入二抗，室温孵育2 h，TBST洗涤，通过加入化学发光液显影，Image J软件分析蛋白条带灰度值，计算蛋白相对表达量。

1.8 各组TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD检测 采用ELISA法。取各组HUVEC细胞，加入胰酶消化细胞，离心弃上清，PBS清洗，然后按照TNF-α试剂盒、IL-6试剂盒、IL-1β试剂盒、MDA试剂盒和SOD试剂盒的说明书进行操作，检测细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和SOD。

1.9 统计学方法 采用Graphpad Prism 7.0统计软件。计量数据符合正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析（组间两两比较采用SNK检验）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SNHG10表达、HUVEC细胞活力和凋亡率比较 与Control组相比，LPS组HUVEC内SNHG10表达、细胞凋亡率升高（P均<0.05），而细胞活力降低（P<0.05）；与LPS+si-NC组相比，LPS+si-SNHG10组HUVEC内SNHG10表达、细胞凋亡率降低（P均<0.05），而细胞活力升高（P<0.05）。见表1。

表1 各组SNHG10表达、HUVEC细胞活力和凋亡率比较（）

表1 各组SNHG10表达、HUVEC细胞活力和凋亡率比较（）

注：与Control组比较，*P<0.05；与LPS+si-NC组比较，#P<0.05。

组别Control组LPS组LPS+si-NC组LPS+si-SNHG10组F P细胞凋亡率（%）4.7 ± 0.8 26.1 ± 1.5*23.1 ± 1.2 16.8 ± 0.9#209.749<0.05 SNHG10相对表达量1.05 ± 0.04 3.12 ± 0.25*3.24 ± 0.19 1.88 ± 0.11#177.289<0.05细胞活力（%）99.4 ± 5.9 48.9 ± 3.4*45.4 ± 2.8 75.6 ± 4.1#107.996<0.05

2.2 各组Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表达比较 与Control组相比，LPS组HUVEC内Bax蛋白表达升高（P<0.05），Ki-67蛋白和Bcl-2蛋白表达降低（P均<0.05）；与LPS+si-NC组相比，LPS+si-SNHG10组HUVEC内Bax蛋白表达降低（P<0.05），而Ki-67蛋白和Bcl-2蛋白表达升高（P均<0.05）。见表2。

表2 各组Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表达比较（）

表2 各组Ki-67、Bcl-2和Bax蛋白表达比较（）

注：与Control组比较，*P<0.05；与LPS+si-NC组比较，#P<0.05。

组别Control组LPS组LPS+si-NC组LPS+si-SNHG10组F P Bax 0.98 ± 0.07 1.75 ± 0.12*1.68 ± 0.11 1.32 ± 0.07#41.815<0.05 Ki-67 1.03 ± 0.05 0.47 ± 0.05*0.52 ± 0.04 0.74 ± 0.06#76.627<0.05 Bcl-2 1.01 ± 0.04 0.38 ± 0.03*0.42 ± 0.03 0.65 ± 0.05#169.831<0.05

2.3 各组TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较 与Control组相比，LPS组HUVEC内TNF-α、1L-6和1L-1β表达升高（P均<0.05）；与LPS+si-NC组相比，LPS+si-SNHG10组HUVEC内TNF-α、1L-6和1L-1β表达降低（P均<0.05）。见表3。

表3 各组TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较（pg/mL，）

表3 各组TNF-α、IL-6、IL-1β水平比较（pg/mL，）

注：与Control组比较，*P<0.05；与LPS+si-NC组比较，#P<0.05。

组别Control组LPS组LPS+si-NC组LPS+si-SNHG10组F P 1L-1β 149.8 ± 9.2 683.2 ± 32.4*664.5 ± 38.1 402.6 ± 21.3#250.359<0.05 TNF-α 104.5 ± 11.2 553.4 ± 29.1*536.6 ± 33.0 289.2 ± 25.1#205.713<0.05 1L-6 123.9 ± 17.5 657.0 ± 45.1*634.5 ± 33.1 363.3 ± 22.4#193.656<0.05

2.4 各组MDA含量和SOD活性比较 与Control组相比，LPS组HUVEC内MDA表达升高（P<0.05），SOD活性降低（P<0.05）；与LPS+si-NC组相比，LPS+si-SNHG10组HUVEC内MDA表达降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05）。见表4。

表4 各组MDA含量和SOD活性比较（）

表4 各组MDA含量和SOD活性比较（）

注：与Control组比较，*P<0.05；与LPS+si-NC组比较，#P<0.05。

组别Control组LPS组LPS+si-NC组LPS+si-SNHG10组F P SOD（U/mL）26.7 ± 2.4 9.8 ± 0.9*10.5 ± 1.1 17.4 ± 0.9#86.193<0.05 MDA（mmol/mL）10.8 ± 1.1 35.4 ± 2.3*33.2 ± 2.7 16.4 ± 1.8#104.895<0.05

3 讨论

血管内皮细胞损伤参与多种心血管疾病的发生发展，而凋亡、氧化应激和炎症反应是导致血管内皮细胞氧化损伤的重要原因［17-18］。多数研究采用HUVEC作为研究心血疾病实验模型，而LPS诱导的HUVEC氧化损伤常作为体外模型［19-20］。本研究结果发现，LPS诱导HUVEC中细胞活力降低；细胞凋亡水平增加，与细胞凋亡相关的蛋白Bcl-2下调，而Bax表达上调；与炎症反应相关的TNF-α、1L-6和1L-1β表达升高；与氧化应激有关的MDA含量升高、SOD活性降低。IL-6、TNF-α和IL-1β是细胞炎性损伤中的重要促炎性因子，在心血管疾病中发挥重要作用［21］。MDA含量的高低可用于测量细胞氧化应激，间接反映氧化自由基的损伤；SOD是一种抗氧化酶，可改善氧化自由基引起的细胞氧化损伤［22-23］。本研究结果证实，LPS可诱导HUVEC细胞的凋亡、炎症反应和氧化应激，与HOU等［21］研究结果相似。

越来越多证据显示，长链非编码RNA在LPS诱导肿瘤疾病中发挥重要作用。如在骨关节炎研究中，LPS可降低骨关节炎软骨细胞的活力，促进细胞损伤和炎性因子的分泌，下调GAS5表达；过表达GAS5可缓解LPS诱导的骨关节炎软骨细胞引起细胞活力、凋亡和炎症反应［24］，本研究结果与之相反。ZHOU等［25］研究发现，通过人肺成纤维细胞建立LPS诱导的肺损伤模型，结果显示，LPS处理细胞后，SNHG16表达下调，敲低SNHG16可以减轻LPS诱导的细胞凋亡和炎症反应，促进细胞活力。CHEN等［26］研究结果显示，LPS诱导HMEC细胞后可促进炎性因子IL-6分泌，HULC、UCA1和MALAT-1表达上调，抑制HULC、UCA1和MALAT-1表达可减缓LPS诱导HMEC细胞的炎性因子分泌。

SNHG10是小核仁RNA宿主基因家族成员之一，是新发现的一种lncRNA［14］。研究结果发现，SNHG10表达上调受抑可抑制细胞增殖和转移，促进细胞凋亡，SNHG10可靶向调控miR-150-5p在胃癌中的作用［27］。LPS诱导的血管内皮细胞损伤发病机制较复杂，本研究结果发现，LPS诱导HUVEC后，SNHG10表达上调；干扰SNHG10可促进LPS诱导HUVEC中细胞活力、SOD活性和Bcl-2蛋白表达增加，抑制细胞凋亡、Bax蛋白、TNF-α、1L-6和1L-1β和MDA含量；干扰SNHG10可对血管内皮氧化损伤起到保护作用，说明SNHG10在HUVEC促凋亡、炎症反应和氧化应激中发挥积极作用，此为SNHG10在心血管疾病的研究提供了依据。

综上所述，干扰SNHG10表达可以减轻LPS诱导的HUVEC凋亡、炎症和氧化应激，促进细胞增殖。