小凹蛋白-1对RAW264.7巨噬细胞衰老相关分泌表型表达的抑制作用及其机制

李培，白玉芝，王晶，茹静

首都医科大学附属北京朝阳医院老年科，北京100043

细胞衰老是动脉粥样硬化（AS）进展的病理生理基础之一，AS斑块内有大量衰老表型的血管细胞，表现为细胞增殖减少、生长抑制和凋亡、DNA损伤增加和线粒体功能障碍。既往研究发现，在AS斑块形成早期即可观察到衰老表型巨噬细胞来源的泡沫细胞［1-2］，但衰老表型的巨噬细胞如何参与AS的机制尚不明确。衰老的巨噬细胞仍然是活细胞，衰老表型巨噬细胞产生的促炎症和基质降解分子增多，如基质金属蛋白酶（MMPs）、组织因子（TF）、白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，被称为巨噬细胞衰老相关分泌表型（SASP）［3］。小凹蛋白-1广泛存在于血管细胞中，与细胞衰老关系密切，是衰老研究的热点。我们的前期研究证实，巨噬细胞RAW264.7中的小凹蛋白-1在其衰老过程中起着重要的作用［4-5］，但其如何参与巨噬细胞衰老影响AS进展的具体机制研究较少。2022年6月—2023年1月，本研究以oxLDL诱导巨噬细胞RAW264.7建立细胞衰老模型，采用病毒感染技术特异性下调小凹蛋白-1在巨噬细胞的表达后，观察巨噬细胞迁移能力及其衰老相关分泌表型的变化，以探讨小凹蛋白-1对巨噬细胞RAW264.7分泌SASP的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠巨噬细胞RAW264.7购自ATCC；oxLDL购自北京协和医科大学；RPMI1640培养液、胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone公司；细胞衰老特异性β-半乳糖苷酶检测试剂盒、ELISA试剂盒、p38激动剂P79350购自Sigma公司；MMP2、MMP9、TF、p38、p-p38、actin多克隆抗体购自美国Abcam公司；细胞迁移实验试剂盒购自Costar公司。

1.2 巨噬细胞的培养及分组处理 采用前期研究方法筛选出下调小凹蛋白-1表达的细胞系［3］，在293FT中利用脂质体2000试剂（Invitrogen）对慢病毒颗粒进行包装。将shRNA质粒转染到包装质粒pCMV和包膜质粒pHCMV-G上，Scramble shRNA作为对照（Ctrl shRNA）。48 h后，4 ℃将含有病毒颗粒的上清液2 000 r/min离心5 min。RAW 264.7细胞按5×105/孔接种在6孔板上（约70%融合）。12 h后，将0.5 mL含有慢病毒的培养上清液添加到含有8 mg/L聚凝胺的接种孔中。接种板在32 ℃、2 500 r/min离心1 h后继续培养。24 h后，将含3 mg/L嘌呤霉素的新鲜培养液加入到接种板中进行筛选，第7天筛选稳定的shRNA表达细胞系（Cav1 shRNA）。之后，选取Ctrl shRNA或Cav1 shRNA感染的巨噬细胞进行实验。分组一：两种细胞分别用oxLDL（60 mg/L）处理或加入等量的PBS处理，分为Ctrl shRNA+ox-LDL组、Ctrl shRNA+PBS组、Cav1 shRNA+oxLDL组、Cav1 shRNA+PBS组。分组二：全部细胞根据处理方式不同分为无血清对照组（PBS）、oxLDL（60 mg/L）组、oxLDL（60 mg/L）+Ctrl shRNA组、oxLDL（60 mg/L）+Cav1 shRNA、oxLDL+Cav1 shRNA+p38激动剂P79350组。

1.3 细胞衰老鉴定 衰老细胞在pH 6.0时有高β-半乳糖苷酶活性，以X半乳糖甘酶（X-Gal）为底物催化下会生成深蓝色产物。按实验分组处理细胞后，室温固定15 min，加入 1mL X-Gal染色工作液，37 ℃无CO2条件下孵育6 h，显微镜下观察每孔标本随机选取5个视野，细胞质蓝染者为衰老细胞，计数衰老细胞占观察细胞总数的百分比。

1.4 巨噬细胞迁移能力测定 采用24孔Transwell板（8 µm膜）检测细胞迁移能力。细胞种入24孔Transwell上层小室，将含有10% FBS的RPMI1640培养基加入到下层小室中，放入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育；待细胞贴壁后予oxLDL（60 mg/L）处理或加入等量的PBS处理24 h，然后小心吸取上室培养基，将小室取出并擦去未迁移过膜的细胞。将膜用4%多聚甲醛固定30 min，使用0.1%结晶紫在室温染色30 min，然后将小室用PBS洗涤3次，置于光学显微镜下观察穿膜细胞。随机选取10个视野进行计数，取平均值来评估细胞迁移能力。

1.5 细胞MMPs、TF、p38磷酸化蛋白表达水平检测 采用Western blotting法。收集各组细胞加入细胞裂解液，提取细胞蛋白，按照BCA试剂盒说明书操作测定蛋白质浓度。按照SDS-PAGE操作说明书配置5%浓缩胶及10%或12%的分离胶进行电泳，每孔上样量30 µg，条件恒压 80 V 30 min、120 V 70 min，电泳后切取相应胶带进行转膜。转膜前聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜甲醇浸泡15 min，转膜条件为恒流200 mA 2 h，用5%牛奶（TBST配置）封闭6 h后，MMP2、MMP9蛋白（1∶ 1 000稀释）、TF蛋白（1∶800稀释）、p38（1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜。经 TBST洗涤3次，每次 10 min，加入HRP标记的特异性二抗以1∶1 500稀释，室温下孵育2 h，加入ECL发光剂，于成像系统中观察蛋白质条带。以actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.6 细胞上清液炎症因子水平检测 收集各组细胞上清液，具体步骤均按照ELISA试剂盒说明操作，检测细胞上清液中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.7 统计学方法 应用SPSS 16统计软件进行资料分析。计量资料符合正态分布以表示，方差齐时多组间比较采用one-way ANOVA检验，两两比较采用post hoc Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组巨噬细胞衰老情况 巨噬细胞衰老百分比Ctrl shRNA+oxLDL组为（37.63% ± 1.24）%、Ctrl shRNA+PBS组为（6.23% ± 0.98）%，Cav1 shRNA+oxLDL组为（18.01% ± 1.86）%。oxLDL（60mg/L）刺激巨噬细胞24h 细胞衰老比例增加，下调小凹蛋白-1在巨噬细胞RAW264.7的表达后，衰老细胞阳性比例减少，差异均有统计学差异（P均<0.05）。

2.2 各组细胞迁移能力 Ctrl shRNA+oxLDL组、Ctrl shRNA+PBS组、Cav1 shRNA+oxLDL组、Cav1 shRNA+PBS组细胞迁移个数分别为（453.7 ±17.64）、（110.82 ± 15.12）、（260.4 ± 14.61）、（120.23 ± 13.98）个。Cav1 shRNA+oxLDL组较Ctrl shRNA+oxLDL组迁移通过聚碳酸酯膜的细胞数减少（P<0.05），提示巨噬细胞迁移能力被抑制。

2.3 各组细胞MMPs、TF蛋白表达 ox-LDL可上调巨噬细胞RAW264.7衰老相关表型的表达，促进MMPs、TF的释放；而病毒感染巨噬细胞RAW264.7下调小凹蛋白-1的表达可减轻上述效应，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表1。

表1 各组细胞MMP9、MMP2、TF蛋白表达水平比较（）

表1 各组细胞MMP9、MMP2、TF蛋白表达水平比较（）

注：与Ctrl shRNA+PBS组比较，aP <0.05；与Ctrl shRNA+oxLDL组比较，bP <0.05。

组别Ctrl shRNA+PBS组Ctrl shRNA+oxLDL组Cav1 shRNA+PBS组Cav1shRNA+oxLDL组TF 0.497 ± 0.062 1.007 ± 0.075 a 0.598 ± 0.092 0.712 ± 0.027b MMP9 0.522 ± 0.093 1.289 ± 0.157 a 0.675 ± 0.180 0.864 ± 0.165b MMP2 0.832 ± 0.154 1.803 ± 0.253 a 0.779 ± 0.074 1.275 ± 0.115b

2.4 各组细胞上清液IL-6、IL-8、TNF-α水平 ox-LDL诱导巨噬细胞衰老后，上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平升高，而病毒感染巨噬细胞RAW264.7下调小凹蛋白-1的表达后，上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平下降，差异均有统计学意义（P均<0.05）。见表2。

表2 各组细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平比较（pg/mL，）

表2 各组细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平比较（pg/mL，）

注：与Ctrl shRNA+PBS组比较，aP <0.05；与Ctrl shRNA+oxLDL组比较，bP <0.05。

组别Ctrl shRNA+PBS组CtrlshRNA+oxLDL组Cav1 shRNA+PBS组Cav1shRNA+oxLD组TNF-α 18.32 ± 0.39 87.30 ± 0.51a 20.33 ± 0.15 21.03 ± 0.23b IL-6 98.76 ± 2.54 198.79 ± 10.17a 102.04 ± 2.39 147.10 ± 12.62b IL-8 96.34 ± 4.85 167.30 ± 9.23 a 98.20 ± 7.32 123.98 ± 5.78b

2.5 各组p38磷酸化蛋白表达 无血清对照组（PBS）、oxLDL（60 mg/L）组、oxLDL（60 mg/L）+Ctrl shRNA组、oxLDL（60 mg/L）+ Cav1 shRNA、oxLDL+Cav1 shRNA+p38激动剂P79350组p38磷酸化蛋白表达分别为0.492 ± 0.021、1.479 ± 0.132、1.516 ±0.149、0.785 ± 0.086、1.403 ± 0.207。oxLDL诱导巨噬细胞RAW264.7衰老后，p38磷酸化蛋白增加，p38MAPK 信号通路被激活；而感染病毒下调RAW264.7细胞中小凹蛋白-1的表达后，p38磷酸化蛋白水平降低；用p38特异性激动剂P79350处理可以逆转下调小凹蛋白-1后衰老相关分泌表型减少这一效应。组间差异均有统计学意义（P均<0.05）。提示小凹蛋白-1可能通过p38 MAPK信号转导通路调控oxLDL诱导的巨噬细胞衰老相关分泌表型的表达。

3 讨论

巨噬细胞是AS的主要参与者。衰老的巨噬细胞可能通过损害胆固醇流出和促进炎症反应来影响AS的发展［6］。上述研究提示巨噬细胞衰老可能参与年龄相关的AS斑块稳定性，但具体机制尚不明确。小凹蛋白-1作为小凹的标志性结构蛋白，在血管细胞中广泛表达，是许多信号分子的支架蛋白和负性调节蛋白，如促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），与AS发生发展密切相关［7］。既往研究发现，在基因敲除小凹蛋白-1缺乏的小鼠中，主动脉壁中的低密度脂蛋白浸润减少，可以逆转AS过程［8］。而另有研究证实，基因敲除小凹蛋白-1缺乏的小鼠平滑肌细胞的增殖及迁移增强，促进新生内膜的增生，促进AS病变形成［9］。因此，小凹蛋白-1在AS中的作用尚不明确。既往多项研究证实，小凹蛋白-1与衰老密切相关。我们的前期研究结果亦显示，下调小凹蛋白-1在巨噬细胞的表达，可以减少NADPH NOX 2亚型中p47phox调节亚基和细胞膜的结合，阻碍NOX2亚型作用的发挥，减少ROS产生，延缓细胞衰老。本研究显示，下调小凹蛋白-1的表达可以减少巨噬细胞衰老，与前期结果一致。

血管壁中的衰老细胞分泌的细胞因子、趋化因子、细胞基质蛋白酶、生长因子等细胞衰老相关分泌表型可发挥多种促AS的作用，如血管重塑、斑块形成和破裂。有证据表明，斑块丰富的动脉含有各种典型的SASP成分，包括基质金属蛋白酶和多种炎症因子。有研究发现，具有衰老标志物的泡沫巨噬细胞与炎性细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶共存，通过SASP发挥致AS作用［10-11］。其中，巨噬细胞的浸润和巨噬细胞MMPs的释放与AS不稳定性有关［12］。本研究为了检测小凹蛋白-1表达对ox-LDL诱导巨噬细胞衰老后炎症因子的影响，通过检测细胞MMP2、MMP9、TF蛋白表达以及细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α水平，发现 ox-LDL诱导巨噬细胞衰老可上调SASP的表达，促进MMPs释放，巨噬细胞迁移能力增加；而采用病毒感染技术特异性下调小凹蛋白-1的表达后，细胞迁移能力减弱，炎症介质分泌减少。既往研究证实，MMPs是调控细胞迁移的关键酶［12］， MMPs表达受MAPK信号通路的调控［13］。小凹蛋白-1是否参与MAPKp38信号通路调控MMPs等衰老相关表型的表达目前尚不清楚。为了研究小凹蛋白-1与p38MAPK通路在这一过程中关系，在特异性下调小凹蛋白-1表达后，使用p38特异性激动剂P79350激活p38的磷酸化蛋白水平，可以逆转下调小凹蛋白-1后衰老相关分泌表型的减少这一效应。因此，结合本研究结果推测，下调小凹蛋白-1的表达可能抑制oxLDL激活的MAPK信号通路，进而下调MMPs的表达，影响衰老巨噬细胞的迁移。因此，oxLDL可以诱导巨噬细胞衰老，使p38MAPK活性增强，细胞迁移能力增加，促进MMPs、TF、IL-8、IL-6等炎症因子表达，而小凹蛋白-1在上述过程中起了重要的作用。

综上，SASP作为细胞衰老的重要标志，与细胞衰老及AS相关，小凹蛋白-1在oxLDL诱导巨噬细胞SASP过程中起着重要的作用。下调小凹蛋白-1在巨噬细胞中的表达，可以延缓细胞衰老，抑制p38MAPK活化及巨噬细胞SASP释放，减弱巨噬细胞迁移能力，有望成为年龄相关性AS防治的新靶点。