电刺激对早期失神经性肌萎缩HDAC4蛋白细胞定位的影响及其相关机制

潘录录，林苏进，蒋旭坚，陈文煜，章国伟，支英豪

浙江中医药大学附属温州市中医院，浙江 温州 325000，1.康复科3；2.康复治疗部

肌萎缩可出现在各种疾病的恢复期，如骨折后制动、脑卒中后瘫痪、肺功能受损后肺活量减少、周围神经损伤后失神经支配等[1]，可导致肌力下降、运动功能减退、胰岛素抵抗、基础代谢率下降等[2-3]，严重影响患者的恢复及日常生活活动能力。目前的研究主要关注长期、慢性的肌萎缩，对于早期、急性期肌萎缩的研究不多。一项研究[4]发现仅在废用早期存在泛素蛋白酶体途径诱导的快速、短暂的肌蛋白降解，随着时间延长这种现象消失，肌蛋白降解率重新回到基础水平，所以中晚期废用性肌萎缩速率反而较早期减低。这项研究为我们打开了一个新视角：既然肌萎缩速率在失神经支配早期更加显著，那么从早期入手研究肌萎缩机制和治疗方法可能具有重要的临床意义。

目前对于肌萎缩机制的研究主要围绕着肌蛋白合成与降解，IIa类组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase,HDACs）被证明在骨骼肌蛋白降解中发挥重要作用，其中HDAC4与骨骼肌障碍关系密切[5]。HDAC4在细胞质和细胞核之间穿梭，充当转录抑制因子，在细胞核内结合并抑制肌细胞增强因子-2（myocyte enhancer factor 2,MEF2）的转录，从而影响骨骼肌的发育及骨骼肌的再生，HDAC4的细胞定位由激酶和磷酸酶的相互作用控制，蛋白激酶A（protein kinase A,PKA）和钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calmodulin-dependent protein kinaseII,CaMKII）是其中的两个典型代表[6]，并且这两者对HDAC4 的细胞定位具有拮抗作用[7-8]。研究表明HDAC4 核内聚集可能是造成肌萎缩的一个重要因素[6]。因此，通过HDAC4的细胞定位来研究早期肌萎缩是一个比较有意义的方向。

我们前期的研究发现慢性废用性肌萎缩中存在HDAC4的细胞定位异常，而通过电刺激能部分逆转这种改变，同时改善肌萎缩情况[9-10]，但影响HDAC4细胞定位的信号通路尚不清楚。本研究通过观察电刺激对失神经性肌萎缩的影响，分析环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,cAMP）/PKA信号通路和Ca2+/CaMKII信号通路关键因子的变化，探究这两条信号通路与HDAC4细胞定位之间的关系。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 CaMKII抗体（4436S，美国CST公司）、PKA抗体（5842S，美国CST公司）、HDAC4抗体（7628S，美国CST公司）、cAMP酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（KGE012B，美国R&D Systems公司）、层粘连蛋白（laminin）抗体（ab11575，英国Abcam公司）、Ca2+浓度检测测试盒（C004-2-1，南京建成生物工程研究所）。电刺激仪（Twin Stim®Plus 3rd Edition Combo Stimulator,Compass Health Brands Corp.Middleburg Heights,OH 44130）。

1.2 实验动物 清洁级成年雄性SD大鼠，初始体质量200～250 g，购自浙江中医药大学动物实验研究中心，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2021-0012，饲养和实验遵守浙江中医药大学动物实验研究中心管理和使用规定，并遵守中国实验动物管理条例。

1.3 实验分组及干预 将24只大鼠编号后按照随机数字表法分成4组：正常对照组（NC组）、单纯肌萎缩模型组（MA组）、肌萎缩+低频率电刺激组（LE组）和肌萎缩+高频率电刺激组（HE组），每组6只。以大鼠的右后肢作为实验侧，造模成功后第2天开始电刺激治疗，在造模后第8天电刺激后取大鼠右后肢腓肠肌。电刺激流程：将所有大鼠固定好，右侧小腿腓肠肌肌腹部局部去毛，放置表面电极片（1.5 cm×1.5 cm）使之完全覆盖肌肉，只有电刺激组大鼠（LE和HE）应用电刺激仪器进行刺激。参数：频率选择根据实验需要（LE组：20 Hz，HE组：100 Hz），斜坡时间（Ramp）选择1 s，脉冲宽度（Width）为300 μs，运作时间（On）为5 s，停止时间（Off）为10 s，输出强度以最大耐受强度为标准（可见局部肌肉收缩，而大鼠无明显烦躁不安），每天持续电刺激时间为30 min，见图1。

图1 大鼠腓肠肌电刺激示意图

1.4 大鼠失神经肌萎缩模型建立 本研究采用大鼠坐骨神经完全损伤模型，以达到小腿及足部肌肉完全瘫痪，造成失神经性肌萎缩状态。需造模的各组大鼠均用10%的水合氯醛（3 mL/kg）经腹膜腔内注射麻醉成功后，取右后肢外侧纵向切口，显露坐骨神经，在坐骨结节处切除长约5 mm的神经纤维，然后在显微镜下用11-0尼龙线将近远端神经外膜缝合至橡胶套管上，间断缝合3～4针，中间缺损的神经纤维给予旷置，最后缝合局部肌肉。NC组除外切除神经部分，其余操作与造模组相同。实验结束后配置10%的水合氯醛，称量每只大鼠的体质量后，按照0.4 mL/100 g的剂量，经腹腔注射麻醉药，待大鼠进入麻醉状态后，迅速分离腓肠肌。分离后的组织一部分迅速放入配置好的4%多聚甲醛固定液中固定24 h，后经梯度蔗糖脱水后用OCT包埋，另一部分组织不经处理迅速放入-80 ℃冰箱保存。大鼠最后经过量的水合氯醛注射处死，实验过程符合实验动物伦理学标准。

1.5 免疫荧光染色检测平均肌纤维横截面积（crosssectional area,CSA）将多聚甲醛固定的腓肠肌制成8 mm厚的冰冻切片。将切片置于玻片上，用封闭剂浸泡60 min，然后将切片与层粘连蛋白抗体在4 ℃孵育过夜，切片用PBS冲洗，与山羊抗兔IgGH&L多克隆二抗在室温下孵育2 h，在荧光显微镜下观察图像。随机选取5个视野进行层粘连蛋白染色，计算CSA。

1.6 透射电镜观察肌纤维和线粒体的超微结构在大鼠被处死后，立即解剖腓肠肌，并在枸橼酸盐缓冲液中冲洗。取体积为1 mm3的肌肉切片，用2.5%的戊二醛预冷固定，然后用1%的四氧化二臭氧后固定，将固定后的肌肉制成超薄切片，用透射电子显微镜（HT7700，日本Olympus公司）观察图像，分析肌纤维和线粒体的超微结构变化。

1.7 ELISA法检测cAMP浓度 选取适量的组织，用预冷的PBS（0.01 mol/L，pH=7.4）冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1 g的组织样品对应9 mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5 000×g离心5～10 min，取上清液检测。从室温平衡20 min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4 ℃。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；样本孔中加入待测样本50 μL；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃水浴锅或恒温箱温育60 min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350 μL），静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入终止液50 μL，15 min内，在450 nm波长处测定各孔的OD值。以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

1.8 比色法检测Ca2+浓度 准确称取组织按重量（g）:体积（mL）=1:9的比例加入去离子水，冰水浴匀浆，2 500 r/min，离心10 min，取10%的匀浆上清液待测；细胞样本收集好后按106个细胞加0.3～0.5 mL的去离子水，超声破碎后，漩涡混匀，2 500 r/min，离心10 min，取上清液待测。按照试剂盒说明书要求混匀各种试剂，静置5 min后，波长610 nm，酶标仪比色，测各孔OD值。用去离子水将2.5 mmol/L钙标准液稀释成不同的浓度：0.062 5 mmol/L、0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.625 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L。按照说明书要求混匀，静置5 min后，波长610 nm，酶标仪比色，测各孔OD值获得钙标准曲线。最后根据说明书提供的公式计算出组织中的Ca2+含量。

1.9 蛋白质印迹（Western blot）法检测CaMKII、PKA、HDAC4蛋白表达 腓肠肌组织放在组织匀浆器中，冰上匀浆后，加入蛋白裂解液及PMSF，冰上放置40 min，4 ℃下12 000 r/min离心40 min，取上清液。以BSA为标准，用BCA法对上清液进行蛋白定量。取20 μg蛋白样品，10% SDS-PAGE电泳，100 V转移1 h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37 ℃封闭1 h；一抗4 ℃过夜。同时，另1张用不含抗体PBS液孵育，作为阴性对照。反复洗膜后，将膜与碱性磷酸酶标记的抗IgG抗体孵育，室温轻摇1 h洗膜后，用Western blot观察，用图像分析测定各带吸光度（A）值作定量分析。

1.10 统计学处理方法 采用SPSS25.0统计软件进行分析。首先对数据进行正态性检验和方差齐性检验，正态分布的计量资料采用±s进行统计描述，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD（方差齐）或Dunnett’T3（方差不齐）法进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠腓肠肌相对重量比较 根据公式：腓肠肌相对重量=肌肉湿重（mg）/体质量（g），计算出每只大鼠的比值。MA组（3.50±0.59）较NC组（4.82±0.43）减少，差异有统计学意义（P＜0.05），HE组（4.59±0.83）较MA组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），且HE组相比LE组（3.47±0.19）增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠腓肠肌相对重量比较

2.2 各组大鼠腓肠肌平均肌纤维CSA和线粒体超微结构比较 大鼠腓肠肌超微结构显示，MA组肌纤维排列紊乱，线粒体空泡变性明显，LE组和HE组都能缓解去神经引起的线粒体异常，且HE组效果更显著。统计分析显示，MA组的平均肌纤维CSA较NC组减少，HE组较MA组增加，差异均有统计学意义（P＜0.05），而LE组与MA组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 平均肌纤维CSA（免疫荧光，标尺为20 μm）和线粒体超微结构（透射电镜，标尺为1 μm）

2.3 各组大鼠HDAC4蛋白表达及其核内外转移比较在结果中观察到HDAC4总蛋白在MA组较NC组表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05），余各组之间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。HDAC4胞浆蛋白在HE组的表达较MA组增加（P＜0.05），较LE组也增加（P＜0.05），余各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。HDAC4胞核蛋白在MA组的表达较NC组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），在HE组的表达较MA组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 HDAC4总蛋白、胞浆蛋白、胞核蛋白表达情况

2.4 各组大鼠HDAC4 相关信号通路表达的比较Ca2+含量在MA组表达较NC组减少，差异有统计学意义（P＜0.05），LE组和HE组的表达较MA组均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；CaMKII蛋白表达与Ca2+类似，在MA组表达较NC组减少（P＜0.05），在LE组和HE组较MA组增加；而cAMP含量在MA组表达较NC组增加（P＜0.05），差异有统计学意义（P＜0.05），在HE组表达较MA组（P＜0.01）和LE组（P＜0.05）均减少，PKA蛋白在MA组的表达较NC组增加，差异有统计学意义（P＜0.05），在HE组的表达较MA组减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图5 各组大鼠HDAC4相关信号通路表达情况比较

3 讨论

一般的观念认为肌萎缩是一个长期、慢性的过程。而在本研究中观察到8 d的失神经支配就可以让大鼠腓肠肌出现较明显的肌萎缩，说明肌萎缩的发生可能是很早期的。此外还观察到HDAC4蛋白表达升高，许多研究可证明肌肉中HDAC4蛋白表达与肌萎缩密切相关。一项研究发现，经过10 d的制动，可以观察到大鼠腓肠肌出现了明显的肌萎缩（-27.3%），同时检测到存在HDAC4的核内聚集现象，HDAC4相关的靶基因如Myogenin、MyoD和Atrogin-1的mRNA水平也明显升高，而这些基因在诱导骨骼肌萎缩中起着重要作用，因此作者认为HDAC4蛋白的核内表达增加可能与肌萎缩相关[6]。在另一项研究中，发现失神经骨骼肌中HDAC4的表达显著增加，而特异性的敲低骨骼肌HDAC4基因（HDAC4 shRNA）后发现HDAC4表达降低的同时失神经诱导的蛋白水解、线粒体自噬和肌纤维类型转化受到了抑制，从而缓解了肌萎缩[11]。综合上述两项研究，我们推测HDAC4高表达可导致肌萎缩，不论是制动引起的废用性肌萎缩还是失神经诱导的肌萎缩。在本研究中观察到MA组的HDAC4总蛋白在造模后出现了明显的高表达，同样高表达的还有HDAC4胞核蛋白，而胞浆蛋白表达无明显增加，说明肌肉失神经支配确实可诱导HDAC4蛋白的高表达，并且HDAC4蛋白表达方式以核内增加为主，因此我们推测这种特异性的HDAC4核内聚集现象可能是加剧早期肌萎缩的重要因素。

在失神经诱导的肌萎缩中，Ca2+/CaMKII是介导HDAC4核外流的主要因子，研究中指出缺乏CaMK磷酸化位点的HDACs对CaMK介导的核外流具有抗性，说明阻断Ca2+/CaMKII信号通路会导致HDAC核外流减少[7]。而β-肾上腺素能通过cAMP激活PKA的主要作用是产生HDAC4的核内流[12-13]。这两条信号通路的变化可能对早期肌萎缩时HDAC4的细胞定位起到关键作用。本研究中观察到MA组的Ca2+/CaMKII信号通路较NC组表达减低，说明在MA组可能存在着因该通路表达减低导致的HDAC4核外流减少；而cAMP/PKA信号通路表达则较NC组增高，这可能导致HDAC4核内流增加。两条信号通路变化的叠加结果可能导致了MA组出现HDAC4核内聚集现象。

目前针对肌萎缩的治疗方式主要是运动疗法和饮食疗法，其中运动疗法可有效地改善肌萎缩[14-15]，但是对于心肺功能受损的患者、老年患者、早期需要局部制动的患者以及无法主动活动肢体的患者，它显然无法起到很好的作用。电刺激是康复治疗中一种重要的局部训练方式，它可以模拟肌肉运动诱发出主动的肌肉收缩，对呼吸系统影响很小，并且在训练时不会对心脏产生过多的负担[16]，可在疾病早期就介入治疗，基于此电刺激非常适合在临床推广使用，具有良好的治疗前景和研究价值。

本研究通过给予肌肉不同频率电刺激的方式研究电刺激介入早期肌萎缩的治疗效果。在本研究中发现，100 Hz的高频率电刺激组（HE组）的CSA的明显增加、线粒体结构的改善，提示高频率电刺激可能有助于改善早期肌萎缩，同时观察到HE组的HDAC4核内聚集明显减少，提示高频率电刺激的抗肌萎缩作用可能与其影响HDAC4细胞定位有关。而在LE组不管是对CSA、线粒体结构还是HDAC4核内聚集都没有明显的改善作用。

电刺激影响HDAC4细胞定位的作用机制可能与Ca2+/CaMKII轴和cAMP/PKA轴有关。一项研究[8]发现在C2C12成肌细胞中应用PKA激活剂可导致HDAC4大量核内聚集，随后应用PKA抑制剂后可逆转这种效果；而在大鼠腓肠肌中直接注射磷酸二酯酶抑制剂以增加细胞内cAMP表达后发现肌肉中PKA水平也升高了，伴随着明显的HDAC4核内聚集以及MEF2活性的显著降低。该实验说明了cAMP介导的细胞内PKA激活能导致HDAC4核内聚集效应增强。在本研究中发现高频率电刺激能降低cAMP/PKA轴的表达，从而减少HDAC4的核内聚集。磷酸化II类HDACs的两个关键上游激酶是CaMK和AMPK[17]。在失神经诱导的肌萎缩中，Ca2+/CaMKII轴是介导HDAC4核外流的主要候选因子[6]。一项研究[18]发现CaMKII和PKA依赖的磷酸化改变能协同调节成人心肌细胞中HDAC4的细胞定位。在这项研究中发现心肌细胞中的CaMKII限制了HDAC4的核内聚集，而PKA倾向于保留HDAC4核内聚集，该研究证明了CaMKII和PKA依赖性信号之间存在多方面的串扰，它协调了HDAC4在静止心肌细胞和电刺激心肌细胞中细胞核和细胞质之间的整体分布。那么在骨骼肌细胞是否也存在CaMKII和PKA依赖性信号之间的串扰呢？另一项研究[19]给出了答案：重复电刺激可激活肌肉纤维中的CaMKII，导致HDAC4核外流。而在重复电刺激时应用二丁酰基cAMP（Db cAMP）以激活cAMP/PKA轴则显著减缓了由电刺激引发的CaMKII的激活以及由此引发的HDAC4的核外流，证实了这两条通路在骨骼肌细胞中的确也存在相互拮抗的关系[20]。本研究的结果也验证了这两者的关系，当应用高频率电刺激后，Ca2+/CaMKII轴的表达明显增加，从而导致了HDAC4的核外流，与前面所述的cAMP/PKA轴的表达减少，HDAC4的核内流减少相对应。因此本研究得出结论，高频率电刺激可能通过协调Ca2+/CaMKII轴和cAMP/PKA轴之间的表达，使得Ca2+/CaMKII轴表达增加，cAMP/PKA轴表达减少，从而使HDAC4核内流减少，核外流增加，以达到减少HDAC4核内聚集、缓解肌萎缩的作用。而20 Hz的低频率电刺激仅对Ca2+/CaMKII轴有影响，使其表达有所增加，但对cAMP/PKA轴表达无明显影响，表明了在LE组可能存在一定程度的HDAC4核外流，但无法抵消因cAMP/PKA轴高表达带来的核内流。这也许就解释了LE组的HDAC4核内聚集现象仍然较为显著，以及逆转肌萎缩效果不显著的原因。同时也间接提示我们，也许HDAC4核内流而非核外流才是导致早期失神经性肌萎缩的关键机制。

综上所述，本研究结果表明，失神经性肌萎缩可能与HDAC4核内聚集有关，高频率电刺激可能通过增加Ca2+/CaMKII轴表达以及减少cAMP/PKA轴的表达影响HDAC4的细胞定位导致其核内聚集减少，达到逆转肌萎缩的作用。本研究尚存在许多不足和需要改进之处：①样本量偏少可能会导致统计误差增大，因此在后续研究中尽可能增加样本量以提高研究结果的可靠性；②本研究中仅设置了两组不同频率的电刺激，不利于深入研究不同电刺激频率之间的差异，后续的研究可该按照一定梯度设置多个频率的电刺激（例如2、20、50 Hz等），以更全面地研究电刺激对结果的影响；③本研究仅设置了8 d的观察点，限制了对早期肌萎缩发展的动态观察，后续的研究应该在早期时间窗口内设置更多的观察时间点（例如24 h、72 h、5 d等），以更好地观察肌萎缩发展的变化；④本研究未进行相关信号通路的敲低表达或阻断处理，无法很好地反向验证结果，后续的研究可以进行相关的研究或增加体外细胞实验，以多重验证结果并提高其可靠性。