大蒜多糖结构及生物活性研究进展

苗昆,刘艳,王杰,隗鑫曈,颜培正,张秀云,赵东升

(山东中医药大学 药学院,山东 济南,250355)

大蒜(AlliumsativumL.)别名胡蒜、蒜头、葫等,属百合科,是世界上最常食用的葱属蔬菜之一,同时也是一种良药,多用于保健品、膳食补充剂和食物[1]。2020版中国药典记载大蒜归脾、胃、肺经,能够解毒消肿、杀虫、止痢,可用于痈肿疮疡、疥癣、肺痨、顿咳、泄泻、痢疾[2]。现代药理学研究表明,大蒜具有广泛的生物活性,能够预防和治疗多种疾病,改善身体机能。大蒜化学成分丰富,主要包括多糖、挥发油、氨基酸、凝集素、皂苷类化合物、黄酮类化合物等[3]。大蒜多糖(garlic polysaccharide,GPS)是大蒜的主要活性成分之一(约占鲜重的26%～30%),显现出多种生物活性和健康益处,例如护肝、抗癌、益生、抗氧化、抗凝血及免疫调节作用等。基于实验原料以及实验方法的差异,学者所获得的大蒜多糖结构特征及生物活性存在一定差异。因此,通过查阅国内外相关文献,对大蒜多糖的结构特征、生物活性进行总结概括,并进一步阐明大蒜多糖结构与生物活性之间的联系,以期为大蒜多糖深入研究及开发提供理论支撑。

1 大蒜多糖的结构特征

多糖是大蒜鳞茎中一类极为重要的生物活性物质,其结构多样且测定受多种因素影响,包括大蒜种类、提取工艺、检测方法等,因而结构分析的研究难度较大。当前,大蒜多糖的结构特征的研究主要集中在平均分子质量、单糖组成、糖链构型等方面(表1)。大蒜多糖平均分子质量的测定常用的仪器分析方法包括高效凝胶过滤色谱法(high performance gel filtration chromatography,HPGPC)、高效体积排阻色谱法(high performance size exclusion chromatography,HPSEC);单糖组成的测定方法包括高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、离子色谱法(ion chromatography,IC)、薄板层析法(thin layer chromatography,TLC)、气相色谱法(gas chromatography,GC);红外光谱(infrared spectroscopy,IR)、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)则主要对多糖主链构型、糖链分支的结构进行分析。

表1 大蒜多糖结构信息Table 1 Structure information of garlic polysaccharide

1.1 平均分子质量

大蒜多糖的平均分子质量范围比较宽广,目前,从大蒜中分离得到多糖分子质量分布范围为1 000～10 000 Da。在大蒜多糖平均分子质量的测定中,大蒜的种类、提取纯化方法、测定方法的不同对大蒜多糖平均分子质量的测定结果都有影响。从金乡大蒜中分离得到中性多糖,采用HPGPC法测定其平均分子质量为6.57×103Da[4]。从山东大蒜中分离得到一种杂多糖,纯化后,采用 HPLC 法测定其分子质量为7.1×103Da[5]。通过三相分配-梯度乙醇沉淀法从生大蒜鳞茎(苍山大蒜)中提取和分离出4种果聚糖(GPS35、GPS50、GPS65、GPS80),采用HPSEC法测定4种多糖的平均分子质量分别为10.62×103、9.52×103、9.48×103、8.93×103Da[7]。从白蒜中分离得到果聚糖,采用HPGPC法测定出其平均分子质量为4.54×103Da[9]。

1.2 单糖组成

大蒜多糖的单糖组成种类丰富,但主要由果糖组成,同时还含有半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等。研究人员得出结果的差异可能是由于大蒜品种或实验方法不同引起的。此外,在高温和酸性条件下,果糖容易脱水和氧化为其他产品,如葡萄糖或5-羟甲基糠醛,可能导致测量值与实际值之间存在差异。从大蒜中分离出多糖组分,采用IC-脉冲积分安培检测法分析其单糖组成,结果表明该多糖主要由果糖及葡萄糖组成,还含有少量的阿拉伯糖、半乳糖、木糖[11]。1个中性多糖从金乡大蒜中分离得到[4],采用HPLC法分析表明中性多糖由果糖和葡萄糖组成,摩尔比为4：1。从山东大蒜分离得到杂多糖[5],采用TLC、GC对其单糖成分进行分析,结果表明,该杂多糖单糖组成主要为果糖,还含有一定量的葡萄糖及少量半乳糖,摩尔比为85：14：1。从新鲜大蒜中提取出鲜蒜多糖(fresh garlic polysaccharide,FGPS)[8],其水解产物经TLC分析,发现 FGPS由果糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成,摩尔比为307：25：32。

1.3 化学结构

多糖是由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成的,其糖链构型是确定一级结构的重要依据,同时与多糖的生物活性有着紧密联系。目前测定多糖糖残基组成和糖苷键连接位点的方法主要为甲基化-GC-MS测定法,糖环形式及糖苷键连接方式主要由IR、NMR测定。从金乡大蒜中分离得到小分子水溶性大蒜多糖(water-soluble garlic polysaccharide,WSGP),结合IR、甲基化和GC-MS分析以及NMR分析表明,WSGP主要含有β-D-Fruf-2,1和a-D-Glcp-1两种单糖残基,同时存在a-D-Glcp-1→2-β-D-Fruf-1→和2-β-D-Fruf-1→2-β-D-Fruf-1→2种键连方式,以β型糖苷键为主[15]。从陈化大蒜中分离出两类不同分子质量的果聚糖HF(分子质量>3.5 kDa)、LF(分子质量<3 kDa)[16],通过NMR检测确定了纯化HF和LF的结构。2种多糖均含有(2→1)-β-D-Fruf糖残基,非还原末端与葡萄糖相连,且在主链上存在β-D-Fruf分支,HF结构见图1。CHEN等[9]以白蒜为原料提取出果聚糖GF,采用IR和NMR测定了GF的化学结构。结果表明GF属于新蔗果三糖类果聚糖,其主链由(2→1)-β-Fruf组成,非还原末端与(2→1)-a-D-Glcp相连,存在(2→6)-β-D-Fruf支链,这与BAUMGARTNER等[17]研究结果(图1)相似,但二者所得果聚糖聚合度存在差异,分别为28、58。

a-大蒜果聚糖HF结构;b-大蒜果聚糖GF结构图1 大蒜多糖存在的结构[16-17]Fig.1 The structure of the presence of garlic polysaccharide

1.4 其他

除果聚杂多糖外,研究人员还发现了大蒜多糖的其他结构。如从湖北恩施大蒜样品中提取纯化出一种含硒多糖[21],通过纸层析法分析出该多糖为与硒有键合状态的甘露聚糖,HPLC测得平均分子质量为15 kDa,与上述相关的研究结果存在很大差异,这表明生长环境会对大蒜中多糖的成分及含量产生巨大影响。

2 大蒜多糖的生物活性

2.1 抗氧化作用

2.2 免疫调节作用

机体免疫系统是由一系列免疫器官、免疫细胞、免疫因子组成,它们在功能上相互协调,共同维持机体内环境稳定和生理平衡,一旦其生长或功能表达受到抑制就会导致免疫力低下,诱发各种健康问题。大蒜多糖能够激活免疫细胞(巨噬细胞、淋巴细胞)增殖分化,促进免疫器官的生长,刺激相关免疫因子的分泌,包括白细胞介素(interleukin,IL)、干扰素(interferon,IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)[33],提高血清中免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)水平及巨噬细胞生成NO的能力[34],对机体的固有性免疫和适应性免疫均有促进作用。此外,硒化修饰可进一步增强大蒜多糖的免疫调节活性[35],具有开发成为新型免疫增强剂的潜力。大蒜多糖的免疫调节作用见表3。

表3 大蒜多糖的免疫调节作用Table 3 Immunomodulatory effect of garlic polysaccharide

2.3 保肝作用

肝脏是机体诸多代谢反应发生的关键器官,多种因素都有可能导致其损伤,如酒精、药物滥用、病毒感染、生物和化学制剂以及相应的肝细胞自身免疫攻击[39]。近年来,由于常规药物的局限性(诱发低钾血症、高血压),学者们对于护肝药物的研究方向逐渐转为安全、毒性低的植物多糖。大蒜多糖作为一种常见易得的植物多糖,具有一定开发价值。

研究表明[40]大蒜多糖可抑制酒精性肝纤维化(alcoholic liver fibrosis,ALF)小鼠肝脏脂质过氧化反应,降低其转化生长因子β蛋白(transforming growth factor beta,TGF-β)和TNF-a的表达水平,抑制细胞外基质活化,减少肝星状细胞的生成,提高了肝脏各项指数。此外,多糖灌胃后,ALF小鼠肠道中乳酸杆菌数量增加,细菌总数和厚壁菌数减少,肠道菌群失调现象得到缓解,这种正向的调节可以作用于“肠—肝”轴改善肝脏损伤。刘超群等[41]从抗氧化角度探讨了大蒜多糖对小鼠酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的影响。ALD导致小鼠机体内的氧化-抗氧化反应失衡,产生了氧化应激的现象,而大蒜多糖的引入能够增强SOD、GSH-Px活性,提高肝脏系统的抗氧化能力,降低氧化应激对肝脏的损坏。

除酒精性肝损伤外,大蒜多糖对伴刀豆蛋白(ConA)、四氯化碳(CCl4)所致肝损伤同样有着一定的保护作用。程富胜等[42]研究表明,大蒜多糖可提高肝损伤小鼠肝组织中SOD活性以及GSH含量,降低了丙二醛的含量,以高剂量组(400 mg/kg)效果最好,可显著缓解ConA所致的免疫性肝损伤,促使SOD的活力和丙二醛的含量恢复至正常水平,其机制与稳定细胞膜结构、抑制肝脏脂质过氧化有关。通过大蒜多糖对CCl4导致的小鼠肝损伤保护作用的组织学观察发现[43],引入多糖后,小鼠肝脏病变症状明显减轻,包括中央静脉瘀血现象消失,水泡、变性颗粒数目减少,肝细胞索排列逐渐清晰,表现出良好的治疗效果。综合上述研究,大蒜多糖对多种原因所致的肝损伤均有保护作用,该功能的实现与大蒜多糖的抗氧化活性、益生作用联系密切,肠道菌群作为治疗肝损伤的新靶点有着进一步研究的价值[44]。

2.4 抗炎作用

炎症是机体对于外界刺激引发的一种防御应激反应,是免疫系统发挥功能的重要体现。疾病的产生往往伴随着炎症,通常情况下,炎症能够促进免疫因子的表达,诱导病变细胞的凋亡。然而,当炎症反应过强,就会对自身组织攻击,对机体造成严重的危害[45]。大蒜多糖具有免疫调节的药理功能,能够缓解免疫失调而引发的多种炎症损伤。SHAO等[46]从金乡大蒜中提取出WSGP,评价其在小鼠模型中改善葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的结肠炎的效果。结果表明,WSGP 通过抑制结肠炎小鼠结肠NF-kB和STAT3信号通路中p65、IkB-a和STAT3蛋白的磷酸化进而抑制炎症因子(IL-6、IL-1b、TNF-a)的表达。此外,WSGP还可以通过改善粘膜屏障、调节肠道微生物群来缓解由DSS诱导的结肠炎。朱薿等[47]研究发现大蒜多糖可显著抑制呼吸道合胞病毒诱导的IL-6和IL-8分泌增多的炎症反应,显现出了抗炎的功效。黑蒜多糖同样具有抗炎活性[48],其对脂多糖诱导的小鼠单核巨噬白血病细胞多种炎性因子的释放均有抑制作用,但效果弱于含硫量高的黑蒜水提物,含硫基团的引入可能对多糖成分的抗炎活性有促进作用。当前,大蒜多糖抗炎活性的研究集中于多糖单体化合物,其化学修饰产物相关报道较少,有必要进一步对其挖掘。

2.5 益生作用

多糖益生效应的关键在于其与肠道菌群的相互作用。大蒜多糖不易被小肠消化吸收,但能进入大肠刺激机体肠道多种有益菌属的选择性生长(益生元效应),使其成为肠道中的优势菌群,进而抑制致病菌,病原菌等菌群的增殖,发挥正常肠道菌群的肠道屏障作用。同时,肠道菌群可对多糖分子进行酵解和利用,促进短链脂肪酸的生成,进一步改善肠道环境,维护机体健康[49-50]。张浩琪等[51]分析了大蒜多糖对小鼠肠道菌群的影响,发现多糖引入后,小鼠肠道菌落多样性增加,菌群丰度增加,其中双歧杆菌、乳酸杆菌数量明显增多,肠杆菌和真杆菌数量减少,初步证实了大蒜多糖具有益生元作用。文献表明大蒜多糖能够缓解幼年大鼠菌群失调而引发的腹泻症状,其作用机制与调节大鼠菌群丰度,促进菌群功能有关[52]。实验结果显示,大蒜多糖灌胃后,大鼠肠道拟杆菌门、乳杆菌属丰度增加,厚壁菌门与变形菌门丰度降低。拟杆菌门和乳杆菌属可酵解多糖,产生丙酸、丁酸和乳酸等有机酸,抑制肠道腐败的作用,净化肠道环境,平衡肠道微生态,从而改善腹泻症状。

大蒜多糖的益生活性与其分子质量及聚合度联系密切,研究表明以不同分子质量聚糖为碳源对长双歧杆菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌进行培养,通过对培养液 pH 和光密度的测定发现,分子质量为300～1 000 Da 的大蒜多糖对益生菌的增殖作用最佳[53]。LU等[4]对大蒜多糖进行酸水解,得到低聚多糖,比较二者的益生元效果发现,低聚多糖对人类胃内酸性条件的抵抗力更强,在乳酸杆菌的培养过程中有着更好的益生效应,可作为功能性食品和营养食品的成分。不同分子质量的大蒜多糖对肠道菌群的影响存在差异,明晰这些差异对益生作用的影响,对于大蒜多糖相关药理活性的改善或许有着一定帮助。

2.6 抗肿瘤、辅助抗肿瘤

大蒜多糖能够抑制肿瘤细胞生长,诱导癌变细胞的凋亡,具有抗肿瘤的功能。TSUKAMOTO等[54]从大蒜鳞茎中提取纯化出分子质量为1 800 Da的新型多糖,研究发现这种新型多糖在体外对人体恶性淋巴瘤细胞和人结肠癌细胞具有细胞毒活性,能显著抑制小鼠体内结肠腺癌细胞的生长。LI等[55]通过MTT实验发现大蒜多糖可抑制人体肝癌HepG2细胞的生长,呈时间及浓度依赖性。高浓度(1.0 mg/mL)的大蒜多糖作用48 h对 HepG2细胞的生长抑制率为26.18%,抑制作用主要集中于HepG2细胞生长分裂的G2期。进一步研究证实,除单独使用外,大蒜多糖还可与顺铂联合使用,通过观察其对人体肝癌HepG2细胞生长的影响,发现大蒜多糖能够增强顺铂对于HepG2细胞的选择性毒性作用,提高促凋亡蛋白Bax活性,加速HepG2细胞的凋亡,降低化疗药物的剂量,表现出了良好的协同抗癌作用[5]。目前大蒜多糖抗肿瘤机制的研究甚少,因而实现临床抗癌药物的转化较为困难,辅助肿瘤治疗的功能性食品或许是其今后的研究方向。

2.7 其他生物活性

除了上述功能外,大蒜多糖还具有改善X射线辐射损伤[56]、缓解疲劳[57]、防治便秘[58]、降低血糖[59]、抑菌[60]、抗凝血[61]等多种生物活性(表4)。作为源于天然产物的活性成分,大蒜多糖在保健食品、药品上具有良好的开发价值。

表4 大蒜多糖其他生物活性Table 4 Other biological activities of garlic polysaccharide

3 大蒜多糖的构效关系

结构特征与多糖的生物活性存在紧密的联系,通过对大蒜多糖的构效关系进行总结以期促进大蒜多糖在食品及其他领域中的应用。

3.1 大蒜多糖分子质量与其生物活性的关系

分子质量能够影响大蒜多糖物理化学性质,如溶解度和黏度,从而影响多糖在体内的吸收。一般而言,过高或过低的分子质量都会降低多糖的生物活性。高分子质量将阻碍细胞对多糖分子的摄取与利用[62]。相反,当分子质量过低时,多糖产生活性的聚合结构可能被破坏,导致其丧失活性[63]。在适当的分子质量范围内,较低分子质量的大蒜多糖往往有着更强的生物活性。例如,相较于高分子质量(6.07 kDa)的黑蒜多糖,经硫酸水解的低分子质量(1.25 kDa)多糖产物具有更强的抗氧化活性[64]。从生大蒜鳞茎提取出多种果糖聚合物,其中最低分子质量(8.93 kDa)的果聚糖在体外显现出最强的抗氧化能力,同时对RAW264.7巨噬细胞生成一氧化氮的刺激活性最强[7]。在大蒜多糖益生活性的研究中同样证实,对于多数益生菌群(双歧杆菌、乳酸菌)而言,菊糖型果聚糖的益生元效应(促益生菌群生长、促短链脂肪酸释放、发酵速度)与其分子质量大小呈负相关[4,53]。因此,分子质量的大小与大蒜多糖多种生物活性密切相关,进一步的研究应当明确这些生物活性所处的最佳分子质量的范围,以优化大蒜多糖在应用中的功效和性能。

3.2 大蒜多糖单糖组成与其生物活性的关系

单糖组成主要包括单糖种类及构成比例。大蒜多糖的单糖组成较为多样,这些不同的单糖组成类型在一定程度上决定了多糖所能显现出的生物活性。研究发现,高含量的糖醛酸可以提高黑蒜多糖的美白效果,其机制与糖醛酸抑制酪氨酸酶活性,进而抑制黑色素生物合成有关[64]。半乳糖可能是大蒜多糖发挥抗凝血功效的关键单糖,因为其具有凝集素识别的配体, 能够阻断凝集素对血液的黏附作用,从而达到抗凝血的效果[61]。甘露糖则具有良好的抗肿瘤活性,在相关实验中发现,甘露糖能够降低己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶活性,抑制糖酵解,从而抑制肿瘤细胞生长[65]。此外,甘露糖还能通过多种途径改善炎症现象,例如,诱导调节性T细胞增殖、抑制效应T细胞功能的表达、抑制巨噬细胞产生炎症因子IL-1b[66-67]。岩藻糖是一种罕见的单糖,在大蒜多糖已知的单糖组成中含量较低,但其具有非常多样的生物活性,包括抗炎、抗癌、抗过敏、抗凝血、抗衰老和保湿功能[68]。不同的大蒜多糖含有不同的单糖组成,这种变化可以部分地解释多糖不同组分之间生物活性的差异。然而,应当注意,多糖结构极为复杂,这些结构对于单糖活性同样存在一定影响,仅仅以单糖来诠释大蒜多糖整体生物活性存在很大的局限性,其具体关联机制仍需进一步探讨。

3.3 大蒜多糖糖苷键与其生物活性的关系

糖苷键是连接2个单糖单元的化学键,根据半缩醛(酮)羟基的构型不同,分为a型和β型。不同糖苷键类型的多糖分子,其生物活性存在极大差异。例如,以β-糖苷键构型为主的多糖通常具有明显的生物活性,而以a-糖苷键构型为主的多糖生物活性相对较弱[63]。这可能是由于人体中存在a-糖化酶,在一定条件下,它可以水解a-糖苷键,致使多糖活性丧失。大蒜多糖为菊糖型果聚糖,其主链主要由β-D-Fruf-2,1结构组成,该类型糖苷键对益生活性有着极为显著的影响。研究发现,β-2,1构型有助于增强菊糖型果聚糖对上消化道中人类消化酶的抵抗力,减少水解对多糖结构的破坏。大肠中的乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌群能够选择性发酵β-2,1果聚糖,生成具有各种功能的代谢物,促进机体维持健康[69]。β-D-Fruf-2,6组成的支链是大蒜多糖化学结构中另一个显著特征。此类构型的果聚糖在调节机体免疫功能,改善炎症反应中发挥着重要作用,其能通过调控炎症因子功能表达、调节免疫蛋白水平、改善肠道菌群组成等直接或间接途径实现促进机体健康的免疫调节作用[70]。

4 结语

大蒜是生活中常用的补益食品,同时在药品、保健品、化妆品等领域应用广泛。多糖是大蒜的主要成分之一,含量较高,生物活性丰富,具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗凝血、改善肠道菌群、抗病毒、神经保护、缓解疲劳等多种功效,且安全性高、毒副作用小,可药食两用。通过查阅相关文献对大蒜多糖生物活性及结构分析研究进行总结发现,大蒜多糖作为大蒜中重要的天然活性成分,具有一定的临床药用价值和良好的保健功能。大蒜多糖主要由果糖组成,不同提取工艺得到的大蒜多糖,其分子质量、单糖组成、糖苷键类型等结构信息存在一定差异。此外,大蒜多糖可经发酵、化学修饰改造为新型多糖产品,如黑蒜多糖、硒化大蒜多糖、磷酸化大蒜多糖、硫酸化大蒜多糖、羧甲基化大蒜多糖等,可用于膳食补充剂、免疫增强剂和辅助药物等,具有广泛应用价值。当前,大蒜多糖提取工艺、药理作用及结构的相关研究取得了一定进展,但也具有局限性,存在诸多亟待解决的问题。比如:a)大蒜多糖的药理作用研究虽然多有报道,但多是体外实验或药效学评价,进一步的作用机制研究仍然较少。b)高级构象是影响多糖生物活性的关键因素,但当前大蒜多糖结构的研究多为分子质量大小、单糖组成、糖链构型等初级结构,对于高级结构及进一步的构效关系的诠释不够清晰。c)大蒜多糖的提取纯化方法虽然不断优化,然而在维持提取多糖的活性方面仍然存在许多问题,如何研究新型提取方法,在保证活性前提下提高多糖得率,仍有待深入研究。综合而言,大蒜多糖的研究依然处于初级阶段,其结构及药理作用的全面揭示还有赖学者们进一步探索。