翅萼石斛花在温度胁迫下的转录组分析

陈宏宇 于 莹

（1贵州中医药大学药学院，贵州贵阳 550025；2贵州中医药大学基础医学院，贵州贵阳 550025）

翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f）为兰科石斛属多年生草本植物，生长于海拔1 100～1 700 m 地区，在我国主要分布于云南等地[1-2]。翅萼石斛的花具有较高的观赏价值，市场上翅萼石斛主要以野外采挖为主，导致野生资源数量锐减。

极端温度是常见的非生物胁迫，对植物生长发育有着重要影响。低温可引起细胞膜结构损伤，造成电解质外渗，氧化代谢平衡失调，活性氧积累，脂类过氧化[3]。低温引起信号分子响应，通过基因转录调控一系列复杂的传导过程，促使特定抗逆功能基因表达。功能基因可提高细胞内渗透调节物质、抗氧化能力和保护酶数量等，使植物产生耐受能力[4]。DREB/CBF（C-repeat binding factor）是AP2/乙烯应答因子DNA结合蛋白，是最早发现的低温调控基因[5]。拟南芥中过表达CBF基因能提高低温耐受特性[6]。类似的还有MAPK、钙调蛋白、CDPK 和ICE转录因子等相关基因[7]。

气候变暖导致高温极端天气增多，对植物产生不可逆转的伤害。高温胁迫会改变细胞膜的流动性和组分变化，内稳态失衡，影响DNA的复制和转录，同时内质网蛋白质产生错误折叠并产生毒蛋白，叶绿体和线粒体功能失常[8]。与低温类似的，高温也是通过信号分子调控转录因子，再启动抗逆功能基因表达。功能基因通过细胞膜、内质网、叶绿体、核酸和代谢等方面的保护作用，使植株产生耐受能力[9]。目前已经发现了TT1、TT2、EF-Tu、GCN5等抗逆基因的分子机制[10]。

高通量测序技术用于大规模分析基因表达并识别基因调控通路[11]。Fowler 等[12]利用基因芯片方法研究了植物低温应答机制，识别了306 个低温应答关键基因，类似的还有马铃薯[13]、番茄[14]等。Zhao等[15]利用测序技术，在高山离子芥测序数据中组装54 870 个基因，并识别了数千个低温调控基因。随后，有关植物低温应答的转录组研究发展迅速，小麦、水稻、香蕉、菠萝、铁皮石斛等，促进了低温应答机制的研究进展[16]。与低温类似的，高温胁迫下的转录组也是植物学研究热点。Li 等[17]利用转录组，研究了柳枝稷高温胁迫分子机制，识别了5 365个差异表达基因。王晓曼等[18]报道了棉花、苦瓜、茶树、牡丹、浒苔、草莓、水稻等亚麻植物相关的高温胁迫转录组研究。

为了研究翅萼石斛花在极端温度胁迫下的基因表达差异和调控通路，本试验对翅萼石斛花开展低温和高温胁迫转录组测序并比较分析，识别翅萼石斛花温度胁迫应答基因，分析调控通路，为进一步研究翅萼石斛花温度响应分子机制提供基础和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料预处理

翅萼石斛由本试验室提供并鉴定，栽培基质为碎松树皮+木屑（3∶1），人工气候室（22 ℃，14 h 光照/d）。处理时将开花的翅萼石斛移入4 ℃和40 ℃进行低温、高温胁迫处理，3 h 后取花。以未胁迫作为对照，称取相同重量，混样后经液氮冷冻提取总RNA。

1.2 RNA提取与测序

利用RNA 提取试剂盒（Invitrogen）提取样本总RNA，通过RQ1 DNA 酶（Promega）进行DNA 消化。纯化后的mRNAs 在95 ℃裂解后修复末端，连接5'接头，利用随机六聚体和带3'接头的RT引物进行反转录。纯化cDNA 被扩增产生150～200 bp 的PCR产物，再进行定量和纯化。利用Illumina IIx 基因组分析系统进行32 nt 单端转录组测序。得到原始测序数据后，以FASTQ格式文件保存。

1.3 基因组装与注释

利用软件Cutadapt（v1.9.1）去除接头序列、去除5'或3'末端质量值低于20 或含N 碱基，去除trim 后reads 长度低于75 bp 的序列。合并所有样本数据后，利用软件Trinity（v2.2.0）进行从头组装，序列聚类后进行序列拼接和冗余去除，得到非冗余长Unigene 序列，统计序列数量与长度分布。利用软件Trans Decoder（v3.0.0）鉴定ORF 序列，以最长的500 个ORF 序列为训练集，利用Markov 模型预测。利用BLAST 软件对Unigene 进行Nr 数据库、SwissProt 数据库、GO 数据库、KEGG 数据库和COG 数据库注释。

1.4 基因表达与调控通路分析

利用FPKM（Fragment Per Kilo Bases per Million Reads）值表示对应Unigene的表达量。使用Bioconductor 软件包的edgeR（v3.4.6）进行差异表达分析，差异基因表达变化2 倍以上且qvalue≤0.05 定义为差异显著基因。

2 结果与分析

2.1 测序与注释

对翅萼石斛花3 个样本测序，去除低质量数据后，分别获得37 422 984、27 744 744和28 053 906个Reads（读长）数据，所有样本Q20 检测值均大于97.54%，Q30检测值均大于93.20%。从头组装后，在3 个组织共获得220 941 条长的、非冗余单基因（Unigene），长度分布在201～16 589 bp，平均长度620.33 bp，GC 含量为40.10%。利用Nr、COG、SwissProt 和KEGG 数据库分别注释了91 380、31 193、45 362和8 462条单基因，共94 784条单基因。

2.2 差异表达基因分析

不同温度对翅萼石斛花诱导基因表达的数量不同。经过计算，与对照相比，翅萼石斛花识别了低温诱导表达基因451 个，低温抑制表达基因856 个；高温诱导表达基因5 411 个，高温抑制表达基因5 020 个。表明翅萼石斛花在受到极端温度后均发生了较大程度的基因表达变化，低温胁迫下调表达基因数量多于上调表达基因，高温胁迫差异表达基因数量多于低温胁迫差异表达基因。

2.3 基因调控通路分析

利用GO 聚类分析对显著差异表达基因进行功能分类，研究具有相同代谢过程或细胞途径的基因类群。结果表明，翅萼石斛花的低温应答基因有30个显著富集功能聚类，分为3 大类：生物过程（Biological process）、细胞组分（Cellular component）和分子功能（Molecular function），分别有13、6 和11 个功能聚类。相应的，翅萼石斛花的高温应答基因，分别有11、12 和7 个功能聚类。表1 和表2 分别列出了排名前5 位的类别。由表1、表2 可知，翅萼石斛花在极端温度胁迫下有大量基因表达，过程涉及膜组成部分、高温胁迫应答、ATP 结合等多个过程，说明这些生物学过程对于翅萼石斛花温度应答非常重要。

表1 翅萼石斛花低温胁迫应答基因的GO聚类分析

表2 翅萼石斛花高温胁迫应答基因的GO聚类分析

利用KEGG数据库对差异表达基因进行生物学功能分析，推测参与生化代谢或信号转导途径基因的相互协调特征。结果表明，翅萼石斛花的低温应答基因归属通路分为5大类：细胞过程、环境信息过程、遗传信息过程、代谢和生物系统分别有1、2、4、22和1个通路（表3）。相应的，翅萼石斛花的高温应答基因归属通路分为4大类：细胞过程、环境信息过程、遗传信息过程和代谢分别有1、1、7和16个通路。

表3 翅萼石斛花低温胁迫差异表达基因的KEGG分析

KEGG 富集分析结果表明，代谢过程是最主要的富集途径。在低温诱导下，代谢和次生代谢途径包含了很多基因。在高温诱导下，基因数量明显高于低温诱导（表4）。

表4 翅萼石斛花高温胁迫差异表达基因的KEGG分析

2.4 温度应答基因表达分析

在数据中查找低温胁迫有关的应答基因，识别了在胁迫信号感知受体中，钙离子信号受体的34个钙调磷酸酶B 类蛋白编码基因（calcineurin B-like protein，CBL）、118 个丝裂原激活蛋白激酶基因（mitogen-activated protein kinase，MAPK）。CBF 途径是植物最重要的低温应答通路，本试验识别了22个可能 的DREB/CBF（dehydration-responsive elementbinding protein/C-repeat binding factor）基因（表5）。如 DN36819_c0_g1_i1（DREB/CBF 1E）、DN73954_c1_g1_i2（DREB/CBF 2A 类似亚型X1）和DN86906_c0_g1_i1（DREB/CBF 2C 类似），在翅萼石斛花受低温胁迫后上调表达，但上调程度较小。DN23757_c0_g2_i1（DREB/CBF 2A 亚型 X1）、DN37118_c0_g4_i1（DREB/CBF 1G）、DN74449_c0_g 2_i2（DREB/CBF 2A 类 似）和DN78101_c0_g1_i1（DREB/CBF 1G），在低温胁迫后下调表达；DN79705_c0_g1_i3（DREB/CBF 2A 类似亚型X2）和DN9972_c0_g1_i1（DREB/CBF 2E 类似）下调明显。值得注意的是，DN30330_c0_g1_i1（DREB/CBF 2A亚型X2）、DN73954_c1_g1_i1（DREB/CBF 2A类似亚型X1）、DN73954_c1_g1_i2（DREB/CBF 2A类似亚型X1）、DN73954_c1_g1_i4（DREB/CBF 2A 类似亚型X1）、DN79705_c0_g1_i1（DREB/CBF 2A 类似亚型X2）和DN84346_c0_g1_i1（DREB/CBF 1C 类似），在翅萼石斛花受高温胁迫后明显上调表达，说明CBF基因不仅在低温应答中起作用，而且可能在植物高温应答中起到重要调控作用（表5）。

表5 翅萼石斛花低温应答基因举例

在数据中查找高温胁迫有关的应答基因，在胁迫信号感知受体中，识别了3个可能的ELF（EARLY FLOWERING）基因，其中DN67438_c0_g1_i3（ELF5亚型X1）在翅萼石斛花受高温胁迫后明显下调表达。在高温胁迫保护基因中，脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）在高温胁迫后降解，增加膜的饱和度以适应高温环境。本试验识别了21 个可能的FAD 基因。热激蛋白（heat shock protein，HSP）能复性错误折叠蛋白，减少毒性蛋白积累。本试验识别了82 个可能的HSP 基因，DN65656_c0_g1_i1（16.0 kDaHSP）、DN18591_c0_g1_i1（16.9 kDa 类型1HSP1）和 DN123520_c0_g1_i1（17.0 kDa 类型2HSP）等多个热激蛋白基因在高温胁迫后明显上调表达。

3 讨论与结论

在植物受到温度胁迫后，低温或高温引起信号分子响应，通过基因转录调控一系列复杂的传导过程，促使特定抗逆功能基因表达[4，9]。翅萼石斛是具有观赏价值的药用植物，温度胁迫分子调控机制尚不明确。本研究利用低温和高温处理翅萼石斛花并进行转录组测序，探讨温度胁迫对其主要代谢通路的影响，为揭示低温和高温调控抗逆反应的分子机制提供基础。

由本研究发现，经低温和高温处理后，翅萼石斛花中部分基因表达发生了显著变化。KEGG富集分析结果表明，经低温诱导的差异表达，基因显著富集途径主要包括代谢和次生代谢途径，而高温诱导的差异表达基因显著富集途径主要包括内质网中的蛋白质加工、RNA 降解、氨酰基tRNA 生物合成、淀粉和蔗糖代谢和甘油酯代谢，涉及的基因更多。具体的分子机制还有待进一步研究。