基于线粒体COI 基因的DNA 条形码在光唇鱼属鱼类系统分类中的应用

李 强 黄文炜 彭苏汉 周江伟 詹华伟 张钰莹 蓝昭军李文俊 桂 林*

（1广州大学生命科学学院，广东广州 510006；2韶关市水产研究所，广东韶关 512006）

光唇鱼属（Acrossocheilus）隶属于鲤形目（Cypriniformes）鲤科（Cyprinidae）鲃亚科（Barbinae）。光唇鱼属鱼类广泛分布于中国南部（包含台湾和海南岛）、越南和老挝[1]。对光唇鱼属各种或亚种的分类鉴定，传统方法主要依据口唇结构形态、体色和背鳍末根不分枝鳍条粗壮程度以及后缘有无锯齿等差异进行划分。Kottelat[2]基于成体体色将光唇鱼属的种或亚种划分为有垂直条纹类群（Barred group）和无垂直条纹类群（Nonbarred group）。然而，光唇鱼属的这些性状除了种间差异显著外，种内差异可能同样显著。袁乐洋[1]通过分析窄条光唇鱼（A. stenotaeniatus）和虹彩光唇鱼（A. iridescens）的形态特征，认为窄条光唇鱼其实是虹彩光唇鱼的幼体；《贵州鱼类志》所记录的厚唇光唇鱼（A. labiatus）应为吉首光唇鱼（A. jishouensis）[3]。因此，在光唇鱼属鱼类的系统分类上，单靠个体形态的差异判断，部分物种难以准确划分。

DNA 条形码通过利用有足够变异的标准化短基因片段对物种进行分子层面上的生物身份识别。越来越多的研究结果都表明DNA 条形码技术能够快速、简便、可信的对鱼类物种进行鉴定[4-7]。其中COI基因相较于其他基因片段，序列长度比较适合，变异足够多，相对保守，所以在物种鉴定上比较合适。本研究通过COI基因通用引物，对所采集的北江光唇鱼（A. beijiangensis）、侧条光唇鱼（A. parallens）、带半刺光唇鱼（A. cinctus）、光唇鱼（A. fasciatus）、虹彩光唇鱼（A.iridescens）和吉首光唇鱼（A. jishouensis）共26 尾个体进行特异性PCR 扩增，所得序列与Genbank 中已发表的光唇鱼属鱼类COI基因进行联合分析，探讨光唇鱼属鱼类的系统发育关系，同时检验COI基因序列对光唇鱼属鱼类鉴别的有效性，以期为光唇鱼属鱼类的系统发育及物种鉴定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集及DNA提取

本研究所使用的试验材料为光唇鱼属的6种鱼类，共计26个个体，分别采自广东省韶关市（北江光唇鱼、侧条光唇鱼）、湖南省吉首市（吉首光唇鱼）、浙江省宁波市（光唇鱼）、广西壮族自治区桂林市（带半刺光唇鱼）和广西壮族自治区河池市（虹彩光唇鱼）。DNA 提取采用上海生工生物公司的柱式试剂盒，提取方法参照试剂盒自带方法进行操作。

PCR引物为Ward等[8]设计的通用引物，具体序列如下：Fish1F（TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC）；Fish1R（TAGA 纯CTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA）。引物由上海生工生物公司合成。PCR 反应总体积25 μL，其中ddH2O 7.5 μL，2 X Tag PCR-Master Mix 12.5 μL，模板DNA 3 μL，上下游引物各1 μL。PCR反应条件设置为94 ℃预变性3 min，进入35 个循环（94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）最后72 ℃延伸5 min。PCR 扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确认目标条带后送往上海生工生物公司完成测序工作。

1.2 序列处理及分析

测序结果首先在NCBI 在线数据库中进行比对检验，以初步确定试验所得序列是目标片段。序列分析采用MEGA 6.0、DNAstar 5.0、BioEdit 7.2.5 等软件进行。用MEGA 6.0 软件对所测序列和所下载序列进行对比，计算序列的碱基组成、各物种的种内和种间遗传距离；采用邻接法（NJ），以双参数法（Kimura 2-parameter）为替代模型，Bootstrap analysis 1 000次重复，构建系统进化树。

从Genbank 中下载其余已发表出来的光唇鱼属的COI基因序列，结合本研究所得的6 种光唇鱼属序列进行比对分析。物种相关信息见表1。

表1 本研究所有13种光唇鱼属鱼类的COI基因信息

2 结果与分析

2.1 光唇鱼属鱼类COI基因碱基组成

本研究所用的引物位于COI基因的5'端，6 种光唇鱼属26 个个体均可以获得线粒体COI基因部分序列，长度约为650 bp。这表明所使用的通用引物适用于本研究的6 种光唇鱼属鱼类，该引物在光唇鱼属中具有一定的通用性。

对26 尾个体的COI基因序列和10 条已发表的光唇鱼属鱼类COI序列进行比对分析，最终保留648 bp 的共有片段，共216 个密码子，包括472 个保守位点、176 个变异位点、143 个简约信息位点和33 个单核苷酸多态性位点，不存在碱基插入和碱基缺失的情况。所有序列的平均碱基组成：28.1%（T）、28.2%（C）、25.7%（A）和18.1%（G）。

2.2 种间及种内的遗传距离

使用MAGE 6.0 软件基于双参数法模型，计算13种光唇属鱼类的种内和种间遗传距离（表2）。由表2可知，种内遗传距离都小于0.020 0，最大的为光唇鱼。各物种种间平均遗传距离，除了北江光唇鱼与窄条光唇鱼种间平均遗传距离（0.015 7）外，其余都分布在0.030 2～0.177 4的范围内，其中半刺光唇鱼与侧条光唇鱼种间遗传距离最小，说明它们是亲缘关系很相近的2个物种，薄颌光唇鱼与其他鱼的种间遗传距离都比较大，都超过0.130 0，最大为0.177 4，所以薄颌光唇鱼与其他光唇鱼属的鱼类亲缘关系都较远。

表2 光唇鱼属鱼类两两比对的种间平均遗传距离

2.3 光唇鱼属鱼类分子系统进化树分析

采用NJ 法构建13 种光唇鱼属鱼类的分子系统进化树，结果如图1 所示。由图1 可知，本研究光唇鱼属的每个物种不同个体都聚在同一分支上，所有6个物种的个体都可形成种的单系。侧条光唇鱼与半刺光唇鱼形成一支，再与吉首光唇鱼聚为姐妹分支，且节点支持率都比较高（高于94%）；北江光唇鱼与窄条光唇鱼结为一支，节点支持率达到100%，再与台湾光唇鱼结为一个分支；带半刺光唇鱼与温州光唇鱼连为一支，再与光唇鱼聚为姐妹分支。虹彩光唇鱼、薄颌光唇鱼各自独立形成一个分支；宽口光唇鱼与云南光唇鱼聚成2 个姐妹分支，再形成一个独立分支。

图1 NJ法构建的光唇鱼属鱼类分子系统树

3 讨论与结论

本研究通过对光唇鱼属鱼类13 个物种的COI基因648 bp 共有片段进行分析，结果表明不同物种的COI基因序列之间具有显著差异，即COI基因作为DNA条形码序列具有一定物种代表性。

本研究中各物种种内遗传距离均小于0.020 0；而种间遗传距离，除了北江光唇鱼与窄条光唇鱼种间平均遗传距离为0.015 7 外，其余都大于0.020 0；种间遗传距离平均值（0.090 1）是种内遗传距离平均值（0.004 9）的18 倍，这与Hebert 等[9]得到的种间与种内遗传距离的结论一致。

从分子系统进化树上看，侧条光唇鱼、吉首光唇鱼、北江光唇鱼、光唇鱼、带半刺光唇鱼、虹彩光唇鱼各自的所有个体均形成单系。侧条光唇鱼与半刺光唇鱼同在一个分支上，节点支持率也比较高，且两者的种间遗传距离也比较小（0.030 2），说明这2 个物种互相的亲缘关系与其他物种比更接近；两者再与吉首光唇鱼聚为一支，节点支持率也比较高。同样，带半刺光唇鱼与温州光唇鱼聚为一支；北江光唇鱼与窄条光唇鱼在系统树上也聚为一支，但两者的种间遗传距离只有0.015 7，因此这2 个物种是否划分为2 个物种有待进一步分析。薄颌光唇鱼在系统树的位置远离其他光唇鱼属物种独立形成一个分支，与其他光唇鱼属鱼类的种间遗传距离都超过0.130 0，表明薄颌光唇鱼与其他光唇鱼属的亲缘关系较远。

窄条光唇鱼最开始由褚新洛等[10]鉴定，并定义为光唇鱼属一个新物种，模式产地为云南剥隘。袁乐洋[1]通过形态学分析，认为窄条光唇鱼是虹彩光唇鱼的幼体。本研究中，通过Genbank 中已发表窄条光唇鱼的COI基因序列与其他光唇鱼属鱼类的比较，结果表明窄条光唇鱼与北江光唇鱼结成一个分支，节点支持率为100%，且窄条光唇鱼与北江光唇鱼的种间遗传距离（0.015 7）小于Hebert 等[9]得出的最小种间遗传距离（0.020 0），窄条光唇鱼可能与北江光唇鱼是相同的物种。

吉首光唇鱼是赵俊等[11]1997 年发表的一个新种，模式产地在湖南吉首，其主要分布于沅江上游及支流。本研究中，在分子系统树上，吉首光唇鱼和侧条光唇鱼与带半刺光唇鱼所结成的分支聚成姐妹分支，且吉首光唇鱼与两者的种间遗传距离（0.050 9和0.052 6）都明显大于0.020 0，表明吉首光唇鱼应为一个有效种。

伍献文[12]根据福建和广西标本形态差异，将半刺光唇鱼和带半刺光唇鱼定义为2 个亚种，即为A. hemispinus hemispinus和A. hemispinus cinctus。袁乐洋[1]通过比较两者的形态特征，认为应将它们提升到种的水平，并将拉丁名分别改为A. hemispinus和A. cinctus。本研究的结果表明，半刺光唇鱼与带半刺光唇鱼的种间遗传距离（0.069 0）明显大于0.020 0，在NJ 系统树上，半刺光唇鱼与侧条光唇鱼结成一个分支，与吉首光唇鱼聚成姐妹群，而带半刺光唇鱼与温州光唇鱼结为一支，与光唇鱼聚为姐妹分支，这与王莉等[13]得出的结论一致。因此，半刺光唇鱼与带半刺光唇鱼应为2个独立的物种。

综上所述，线粒体COI基因适合于光唇鱼属鱼类系统发育分析，且可以作为DNA条形码对该属鱼类进行有效的分子鉴定。