紫外光/核黄素-维生素E聚乙二醇琥珀酸酯交联方案对兔眼角膜基质超微结构和胶原纤维的影响△

魏升升 李 晶 张耀花 蔡 艳 杜 婧 高金荣 刘建国 李 娟 李 勇

角膜胶原交联手术是利用核黄素在紫外光的作用下,被激发到三线态,从而产生以单线态氧为主的活性氧族,活性氧族可以诱导相邻胶原纤维的氨基间发生化学交联反应,形成新的共价键,从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗角膜扩张的能力,使角膜形态更加稳固。目前,角膜胶原交联手术已成为扩张性角膜疾病的主要治疗方法。标准的“Dresden”交联方案是在去除患者角膜上皮后用1g·L-1的核黄素溶液浸泡角膜组织 30 min[1];然后用光照度为3 mW·cm-2、光束直径为9 mm 、波长为370 nm 的紫外光照射角膜30 min;照射总能量为 5.4J·cm-2。由于“Dresden”交联方案手术时间长,对患者角膜厚度要求较高,所以Rubinfeld等[2]采用核黄素-维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(Ribocross®IROMED Group,意大利)进行交联,该方案可以对保留上皮的薄角膜进行个性化的交联,也称为个性化快速角膜胶原交联手术(Custom Fast-Corneal Cross-Linking,CF-CXL),该方案在临床试验方面取得了较好的疗效[3-4]。目前,国内对于CF-CXL手术疗效及术后个体角膜变化的基础研究较少。本研究通过对活体兔眼角膜进行CF-CXL,观察术后不同时间兔眼角膜透明度、超微结构和胶原纤维的变化,分析CF-CXL 对兔眼角膜基质超微结构和胶原纤维的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选取15只10～15周龄SPF级新西兰大白兔进行实验,体重 2.5～3.0 kg,雌雄不限。所有动物在标准的实验室条件下饲养,并保持健康,无临床可观察到的眼病。所有动物右眼作为实验眼,均行CF-CXL,左眼作为对照眼。手术过程中均肌肉注射5 mg·kg-1盐酸噻嗪(Sigma Chemicals.,澳大利亚)和 50 mg·kg-1盐酸氯胺酮(Sigma-Aldrich.,美国)进行麻醉。术后,局部使用 3 g·L-1左氧氟沙星滴眼液(Santen,Inc.,日本)控制感染。术后 1 周、1 个月和 3个月,分别随机选取5只兔注射过量戊巴比妥钠(Pure Chemistry Scientific Inc.,美国)处死,取中央区角膜进行透射电镜检查。该研究经西安市人民医院(西安市第四医院)伦理委员会论证,符合视觉和眼科研究协会声明中关于在眼科研究中使用动物的指导方针,遵循国家实验动物管理保护条例。

1.1.2 仪器与设备

显微手术器械、裂隙灯显微镜(苏州六六视觉科技股份有限公司),眼前节OCT(德国 Carl Zeiss 公司),透射电镜(日本日立HITACHI公司)。

1.2 方法

1.2.1 CF-CXL方法

使用CF-CXL手术设备CF-X Linker(IROMED Group S.R.L.,意大利)对兔右眼行CF-CXL。手术前使用奥布卡因滴眼液(Benoxil,Santen,Inc.,日本)进行表面麻醉。采用低负压核黄素浸泡槽吸附到兔角膜表面,将含有 1 g·L-1核黄素、5 g·L-1维生素E聚乙二醇琥珀酸酯和100 g·L-1葡聚糖的等渗溶液(Ribocross®IROMED Group,意大利)注射入核黄素浸泡槽内,持续浸泡15 min。然后,用平衡盐溶液反复冲洗手术眼以去除角膜表面核黄素薄膜。采用 CF-X Linker设备进行紫外光照射,照射区域直径为7 mm,紫外光照度为(1.8±0.9)mW·cm-2,持续照射时间为 10 min,总能量密度为(1.08±0.6)J·cm-2,照射模式为脉冲式,照射期间于角膜表面每 20 s滴平衡盐溶液1次。照射结束后,局部使用 3 g·L-1左氧氟沙星滴眼液(Santen,Inc.,日本)和1 g·L-1氟米龙滴眼液(Santen,Inc.,日本)1周,控制角膜感染和炎症反应。

1.2.2 裂隙灯及眼前节OCT检查

在术前和术后 1 周、1个月 和 3个月对实验眼和对照眼角膜组织进行裂隙灯显微镜和眼前节OCT检查,观察角膜的透明度、角膜厚度以及角膜胶原交联反应发生的深度。

1.2.3 透射电镜检查

在术后不同时间,取角膜中央3 mm区域组织,浸泡在体积分数2.5%戊二醛中固定。再放入 4 ℃ 0.1 mmol·L-1二甲基胂酸盐(pH 7.3)中,经过几次缓冲液冲洗后,用 1 g·L-1四氧化锇固定,在梯度乙醇系列(体积分数50%到100%)和体积分数100%丙酮中进行组织脱水。在丙酮和TAAB 031树脂的混合物中浸泡8 h,在纯TAAB 031树脂中浸泡8 h(3次),在60 ℃的纯TAAB 031树脂中聚合12 h。随后使用超薄切片机获得50～80 nm 厚度的半薄和超薄切片,把这些切片收集在铜网格上。 将切片用20 g·L-1乙酸双氧铀和20 g·L-1柠檬酸铅溶液染色,并用透射电镜进行观察。图像的数字记录使用Mega 视图数码相机系统处理。每个组织切片使用3张图像进行定量分析。采用角膜胶原纤维横截面面积来评估胶原纤维的变化,避免因为胶原纤维的不规则引起的直径测量误差。使用ImageJ图像处理软件测量胶原纤维横截面面积。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 实验眼角膜术后裂隙灯显微镜观察结果

裂隙灯显微镜下观察可见,实验眼术后1周组、1个月组和3个月组角膜均保持透明,无角膜上皮损伤、角膜上皮下雾状混浊以及角膜瘢痕发生。

2.2 实验眼OCT检测结果

眼前节OCT检测结果显示,与术前相比,实验眼术后1周组中央角膜厚度变薄,术后1个月组和3个月组变化不大。实验眼术后1个月组和3个月组可见角膜基质纤维板层有高反光表现,这可能与胶原纤维交联发生后纤维板层排列不规则有关(图1)。

A:术前;B:术后1周组;C:术后1个月组;D:术后3个月组。图1 实验眼角膜OCT检测结果

2.3 实验眼透射电镜检查结果

透射电镜检查结果显示,实验眼术后不同时间组均可见角膜基质中横行、纵行、斜行的胶原纤维板层分布,胶原纤维板层之间角膜基质细胞填充(图2A);角膜基质细胞内可见散在分布的胶原原纤维(图2B);在胶原纤维的纵切面中,纤维周边可见错综分布的蛋白多糖装饰(图2C);胶原纤维的横切面可用于计算纤维的横截面面积(图2D)。

A:平行和垂直交错的胶原纤维板层;B:角膜基质细胞内可见到胶原原纤维;C:纤维周边可见错综分布的蛋白多糖装饰;D:胶原纤维的横切面。图中L示胶原纤维板层,CF示胶原纤维,PG示蛋白多糖。图2 实验眼角膜透射电镜检查结果

2.4 各组胶原纤维横截面面积

与对照眼相比,实验眼术后1周组、1个月组和3个月组兔眼角膜胶原纤维横截面面积均明显增大,差异均有统计学意义(均为P<0.001),并且术后1个月组兔眼角膜胶原纤维横截面面积大于术后1周组和3个月组,差异均有统计学意义(均为P<0.001)。与对照眼相比,实验眼术后1个月组胶原纤维横截面面积增加21.37%,表明兔眼角膜经CF-CXL手术处理后增加了角膜的胶原纤维直径(表1)。

表1 各组胶原纤维横截面面积比较

3 讨论

角膜胶原交联手术是一种加固角膜、控制扩张性角膜疾病进展的治疗方法。采用光敏剂(核黄素)和紫外光在角膜基质中可产生光化学反应,在胶原原纤维和基质纤维之间形成共价键[5],可以增加角膜的生物力学稳定性以及抵抗蛋白水解酶消化的能力[6-7]。

快速跨上皮角膜胶原交联手术保留了角膜上皮层,可减少去除角膜上皮后带来的角膜感染、角膜融解、疼痛、上皮下雾状混浊等并发症发生的风险[8]。另一方面,由于角膜上皮的存在,上皮细胞层的亲脂疏水性、表面的跨细胞膜蛋白、细胞质蛋白和细胞骨架蛋白可构成细胞间紧密连接,形成了对水溶性药物经细胞间旁路渗透的屏障。亲水性的核黄素溶液很难通过细胞间隙途径进入角膜基质内。有研究者尝试用其他促渗剂帮助核黄素更好地渗透入角膜基质,Caruso等[9]尝试用维生素E聚乙二醇琥珀酸酯增强核黄素溶液和低通量紫外光进行跨上皮角膜胶原交联,局部应用该增强型核黄素溶液浸泡角膜15 min,然后使用CF-X Linker交联仪进行紫外光照射。目前,对于该增强型核黄素溶液的跨上皮交联手术报道较少。多数学者认为,角膜胶原交联的发生主要在胶原原纤维表面之间或胶原原纤维与蛋白多糖的基质之间[10-11],而胶原分子内部或胶原分子之间是否产生交联反应,目前报道较少。本研究通过对兔眼角膜进行Ribocross®增强型核黄素交联手术治疗,观察交联术后角膜基质胶原纤维的变化情况。

在本实验中,交联术后1周、1个月、3个月所有兔眼均保持透明,无角膜上皮损伤、角膜上皮下雾状混浊以及角膜瘢痕发生。这表明CF-CXL方案对于角膜是安全的,包括角膜上皮细胞以及角膜内皮细胞。由于角膜上皮的存在,浸泡 Ribocross®核黄素溶液15 min后,冲洗角膜表面核黄素溶液,角膜上皮细胞中仍存在Ribocross®核黄素溶液,在紫外光照射过程中该溶液也会扩散到角膜基质中,保护角膜内皮细胞。术后角膜基质胶原纤维板层排列整齐,局部可见纤维板层收缩,这可能与胶原纤维之间的蛋白多糖发生交联导致胶原纤维之间间距缩小,组织变紧实有关。这种改变与临床中交联术后早期患者角膜厚度会出现轻度的变薄相一致[12]。在角膜基质细胞中,可见散在分布的细小的胶原原纤维。以往的研究[13]认为,交联术后角膜基质中产生的胶原原纤维可能与角膜基质细胞的再生和增殖等有关。这种细胞的应激性反应也可能会导致角膜基质中胶原纤维量的增加,但胶原原纤维在基质中的排列是否规则,是否对角膜的透光度产生影响导致散射增加,产生暂时性的视觉质量下降,需要做进一步研究。

根据以往的研究,角膜胶原纤维随着年龄的增长所发生的自然交联可以导致胶原纤维横截面面积亦增加[14]。而额外的糖基化,如糖尿病患者,可以导致胶原纤维横截面面积增加约50%[15]。Fullwood等[16]研究显示,戊二醛交联可以增加胶原蛋白分子相关的面积约11%[17]。Wollensak等[18]用扫描电子显微镜观察兔眼角膜“Dresden”交联术后角膜上皮、基质和角膜内皮细胞,发现前部基质胶原纤维收缩且胶原纤维直径增大。在我们的研究中,交联术后1周、1个月和3个月角膜组织中胶原纤维增粗,胶原纤维横截面面积增加,1个月时横截面面积增加约21.37%。这表明CF-CXL术后可以起到有效增加胶原纤维直径的作用,其机制可能是手术增加了胶原蛋白分子内部或者胶原蛋白分子之间的交联作用。

本研究从裂隙灯下观察角膜透明度、眼前节OCT测量角膜前部基质的致密性到采用透射电镜观察角膜基质细胞的反应和胶原纤维横截面面积,对CF-CXL治疗的安全性和有效性进行分析。不足之处在于CF-CXL交联术后角膜基质反应的深度(即交联线的深度)未能从眼前节OCT中反映出来。另外,本研究对胶原纤维之间的蛋白多糖修饰的变化未能进行定量化的分析。

4 结论

CF-CXL可以有效增加兔眼角膜基质胶原纤维的直径,对厚度较薄的圆锥角膜是一种安全、有效的交联方式。