基于Wnt/β-catenin信号通路探究化瘀止痛贴膏对大鼠急性软组织损伤的改善作用

王适 胡立志 王珊 左姿 王敏

急性软组织损伤是临床常见的运动损伤,其特点是疼痛、局部水肿、瘀伤、肌纤维断裂和肢体活动障碍[1]。此外,此类损伤可造成局部皮下软组织出现一系列急性挫伤或/和撕裂,严重影响患者的生活质量[2]。目前,针对急性软组织损伤的治疗主要以对症处理为主,仍无特效药。西医多通过联合应用西药来改善患者疼痛,减轻肿胀,虽然有一定疗效,但弊端也日渐明显[3]。因此,开发安全高效的药物来改善急性软组织损伤具有重要的意义。化瘀止痛贴膏为湖南中医药大学第二附属医院院内制剂,具有化瘀解毒,消肿止痛之功效。已有研究报道,化瘀止痛贴膏治疗急性软组织损伤所致肢体肿痛患者的临床效果良好[4]。但具体机制尚不明确。相关研究显示,抑制Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路可减轻膝骨关节炎兔软骨组织损伤[5]。但化瘀止痛贴膏能否通过调控Wnt/β-catenin信号通路改善大鼠急性软组织损伤尚不明确。因此,本研究主要探究化瘀止痛贴膏对急性软组织损伤大鼠的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 96只雄性SD大鼠(210～220 g),6周龄,由广东莱迪生物医药研究院有限公司提供,生产许可证号SCXK(粤)2022-0064。所有动物实验经本院动物保护与使用委员会批准进行。

1.2 主要试剂 化瘀止痛贴膏医院自制;精制狗皮膏购自重庆陪都药业股份有限公司;氯化锂(Lithium chloride monohydrate,LiCl)购自上海源叶生物科技有限公司;大鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA试剂盒均购自上海烜雅生物科技有限公司;兔源一抗Wnt-16、β-catenin、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-3、MMP-13、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、GAPDH及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自英国Abcam公司。

1.3 急性软组织损伤大鼠模型的构建 2%戊巴比妥钠麻醉大鼠,脱去大鼠右侧大腿毛发,将大鼠仰卧位固定,在大鼠右后肢下垫海绵垫以防骨折,再用500 g砝码连续6次自20 cm处高度垂直自由落下击打大鼠大腿骨直肌部位,以构建急性软组织损伤大鼠模型[6]。若观察到大鼠受伤后一直保持后肢肌肉肿胀状态则视为模型构建成功。

1.4 动物分组 按照随机数字表法将96只大鼠随机分为对照组、模型组、化瘀止痛贴膏低剂量组、化瘀止痛贴膏中剂量组、化瘀止痛贴膏高剂量组、精制狗皮膏组、LiCl(Wnt/β-catenin信号通路激活剂)组、化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组,每组12只。除对照组外,其他组大鼠均需按照1.3所述方法构建急性软组织损伤模型。建模成功后,进行给药处理。根据预实验结果,化瘀止痛贴膏低剂量组、化瘀止痛贴膏中剂量组、化瘀止痛贴膏高剂量组大鼠分别于造模部位贴敷剂量为0.16 g/贴、0.32 g/贴、0.64 g/贴的化瘀止痛贴膏,且均需尾静脉注射等量的0.9%氯化钠溶液;精制狗皮膏组[7]大鼠需在造模部位贴敷剂量为1.05 g/贴的精制狗皮膏,且还需尾静脉注射等量的0.9%氯化钠溶液;LiCl组[8]大鼠需尾静脉注射15 mg/kg LiCl且需在造模部位贴敷不含药的空白凝胶贴膏;化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组需在造模部位贴敷剂量为0.64 g/贴的化瘀止痛贴膏,且还需尾静脉注射15 mg/kg LiCl;对照组、模型组大鼠需在造模部位贴敷不含药的空白凝胶贴膏且还需尾静脉注射等量的0.9%氯化钠溶液,给药1次/d,持续1周。

1.5 标本收集 末次处理24 h后,每组选取全部大鼠,进行软组织损伤评分;软组织损伤评分结束后,2%戊巴比妥钠麻醉并处死大鼠,收集大鼠软组织损伤组织,分为2部分,每部分包含6只大鼠的软组织损伤组织,一部分浸入4%多聚甲醛中用于HE染色,另一部分储存在液氮中用于ELISA、qRT-PCR和Western blot实验。

1.6 大鼠软组织损伤评分 通过皮肤颜色、肌肉肿胀、皮下瘀血、疼痛反应等几个方面的变化来评估急性软组织损伤情况。(1)皮肤颜色:2分为暗紫色,1分为暗红色,0分为肤色正常。(2)肌肉肿胀:2分为肌肉明显肿胀,1分为肌肉略有肿胀,0分为肌肉无肿胀。(3)皮下瘀血:2分为瘀血面积1～2 cm2,1分为瘀血面积0～1 cm2,0分为无瘀血。(4)疼痛反应:2分为触损伤处皮肤疼痛反应明显,1分为触损伤处皮肤疼痛反应轻,0分无疼痛反应,观察并统计总分。

1.7 HE染色检测大鼠软组织损伤组织病理变化 将固定在4%多聚甲醛中的软组织损伤组织包埋在石蜡中,并切成5 μm厚的切片,经HE染色后。利用光学显微镜观察大鼠软组织损伤组织病理变化。

1.8 ELISA法检测大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量 严格按照试剂盒说明书步骤检测大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量。

1.9 qRT-PCR 检测大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表达 用TRIzol试剂提取大鼠急性软组织损伤组织匀浆总RNA。将RNA逆转录为cDNA后,以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应。以GAPDH为内参基因,通过2-ΔΔCt法计算Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA的表达水平。见表1。

1.10 Western blot检测大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 蛋白表达 使用RIPA缓冲液从大鼠急性软组织损伤组织中提取总蛋白,将蛋白质经定量、电泳、转膜、封闭后,将膜分别与一抗Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2、GAPDH在4℃下过夜孵育,再与二抗共同孵育2 h,使用ECL试剂可视化蛋白质条带,利用Image J软件评估蛋白条带灰度。

2 结果

2.1 化瘀止痛贴膏对8组大鼠软组织损伤评分的影响 与对照组比较,模型组大鼠软组织损伤评分升高(P<0.05);与模型组比较,化瘀止痛贴膏低剂量组、化瘀止痛贴膏中剂量组、化瘀止痛贴膏高剂量组、精制狗皮膏组大鼠软组织损伤评分降低(P<0.05);与模型组比较,LiCl组大鼠软组织损伤评分升高(P<0.05);与化瘀止痛贴膏高剂量组比较,化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组大鼠软组织损伤评分升高(P<0.05)。见表2。

表2 8组大鼠软组织损伤评分比较 n=12,

2.2 化瘀止痛贴膏对8组大鼠急性软组织损伤组织病理变化的影响 对照组大鼠软组织形态正常,肌肉纤维结构完整;模型组大鼠肌肉纤维结构破坏,且可见大量炎性细胞浸润;与模型组比较,化瘀止痛贴膏低剂量组、化瘀止痛贴膏中剂量组、化瘀止痛贴膏高剂量组、精制狗皮膏组大鼠软组织病理损伤有所改善;与模型组比较,LiCl组大鼠软组织病理损伤加剧;与化瘀止痛贴膏高剂量组比较,化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组大鼠软组织病理损伤严重。见图1。

图1 8组大鼠急性软组织损伤组织病理变化(HE染色×200)

2.3 化瘀止痛贴膏对8组大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量的影响 与对照组比较,模型组大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量升高(P<0.05);与模型组比较,化瘀止痛贴膏低剂量组、化瘀止痛贴膏中剂量组、化瘀止痛贴膏高剂量组、精制狗皮膏组大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,LiCl组大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量升高,差异有统计学意义(P<0.05);与化瘀止痛贴膏高剂量组比较,化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 8组大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量比较 n=6,pg/mg,

2.4 化瘀止痛贴膏对各组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表达的影响 与对照组比较,模型组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表达升高(P<0.05);与模型组比较,化瘀止痛贴膏低剂量组、化瘀止痛贴膏中剂量组、化瘀止痛贴膏高剂量组、精制狗皮膏组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表达降低(P<0.05);与模型组比较,LiCl组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表达升高(P<0.05);与化瘀止痛贴膏高剂量组比较,化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表达升高(P<0.05)。见表4。

表4 8组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表达比较 n=6,

2.5 化瘀止痛贴膏对各组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表达的影响 与对照组比较,模型组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,化瘀止痛贴膏低剂量组、化瘀止痛贴膏中剂量组、化瘀止痛贴膏高剂量组、精制狗皮膏组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,LiCl组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表达升高(P<0.05);与化瘀止痛贴膏高剂量组比较,化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表达升高(P<0.05)。见图2,表5。

图2 Western blot检测大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白;A 对照组;B 模型组;C 化瘀止痛贴膏低剂量组;D 化瘀止痛贴膏中剂量组;E 化瘀止痛贴膏高剂量组;F 精制狗皮膏组;G LiCl组;H 化瘀止痛贴膏高剂量+LiCl组

表5 8组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表达比较 n=6,

3 讨论

急性软组织损伤的主要病理变化是外伤性无菌性炎症,表现为毛细血管扩张、局部组织坏死、水肿和出血[9]。近年来,通过使用钝器创伤构建急性软组织损伤模型的研究数量有所增加。在本研究中,我们使用500 g砝码连续6次自20 cm处高度垂直自由落下击打大鼠大腿骨直肌部位以构建急性软组织损伤模型,结果发现,与对照组比较,模型组大鼠软组织损伤评分升高,肌肉纤维结构破坏,且可见大量炎性细胞浸润,表明急性软组织损伤大鼠模型构建成功。TNF-α、IL-1β是常见的促炎性因子,已有研究报道,降低损伤组织中TNF-α、IL-1β含量可改善急性软组织损伤大鼠炎性反应[10]。本研究结果与其是一致的,本研究显示,与对照组比较,模型组大鼠急性软组织损伤组织中TNF-α、IL-1β含量升高,表明急性软组织损伤大鼠存在炎性反应。

化瘀止痛贴膏由黄柏、赤芍、大黄、白芍、当归、栀子、石膏、牡丹皮、柴胡、黄芩、红花、姜黄、香附、龙胆共十四味中药组成。方中黄柏为君药,具有燥湿泻火解毒之功效[11];赤芍、大黄共为臣药。大黄得赤芍直入血分,破血中之滞,起解毒疗疮之效。赤芍得大黄则祛瘀力宏。两药合用具有泄热逐瘀,和营止痛等功效[12]。剩余诸药均为佐药。纵观全方,组方严谨,配伍得当,不仅能达到化瘀解毒、消肿止痛等治疗效果,且前瞻性的考虑到本病的转变规律,亦可防治热毒瘀久,耗液伤津。已有研究报道,化瘀止痛膏治疗桡骨茎突狭窄性腱鞘炎效果显著[13];化瘀止痛膏外敷治疗外伤陈旧性关节炎效果明显[14]。而关于化瘀止痛贴膏对急性软组织损伤的影响鲜有报道。急性软组织损伤归属于中医学中的“伤筋、软伤”范畴,损伤组织出血、凝血等过程均可影响损伤组织的修复[15]。本研究结果显示,化瘀止痛贴膏可呈剂量依赖性地抑制急性软组织损伤大鼠炎性反应,并改善软组织病理损伤。提示局部外用化瘀止痛贴膏治疗急性软组织损伤可能通过改善损伤组织的微循环,抑制损伤组织的炎性反应而发挥作用。

Wnt家族蛋白Wnt-16可启动Wnt信号转导途径,β-catenin作为Wnt信号通路中的一个重要组成部分,被Wnt-16激活后,β-catenin的异常高表达水平调节着下游信号MMP-3、MMP-13和BMP-2的表达,进而参与疾病的进展[16]。据报道,阻断Wnt/β-catenin信号通路的活化可改善膝骨关节炎兔软骨组织病理损伤[17];下调脾虚湿困模型大鼠小肠组织Wnt/β-catenin通路蛋白表达,可修复肠道黏膜损伤,发挥益气健脾利湿的功效[18];抑制Wnt/β-catenin信号通路可减轻脓毒症大鼠急性肺损伤[19];下调Wnt/β-catenin信号通路可改善急性心肌梗死大鼠心肌损伤[20]。以上研究表明抑制Wnt/β-catenin信号通路可抑制多种疾病的进展。本研究结果与其是一致的,本研究显示,与模型组比较,LiCl组大鼠急性软组织损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA及蛋白表达升高,且大鼠炎性反应及软组织病理损伤加剧,表明Wnt/β-catenin信号通路确实参与了大鼠急性软组织损伤过程。此外,本研究还发现,化瘀止痛贴膏可呈剂量依赖性地抑制急性软组织损伤大鼠损伤组织中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA及蛋白表达,推测化瘀止痛贴膏可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路改善大鼠急性软组织损伤。为了验证该推测,本研究在高剂量化瘀止痛贴膏作用的基础上再加上Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl来干预急性软组织损伤大鼠,结果显示,LiCl减弱了高剂量化瘀止痛贴膏对急性软组织损伤大鼠炎性反应及软组织病理损伤的改善作用,证实了猜想的正确性,即化瘀止痛贴膏可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路改善大鼠急性软组织损伤。

综上所述,化瘀止痛贴膏可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路改善大鼠急性软组织损伤。化瘀止痛贴膏对大鼠急性软组织损伤的改善作用可能还涉及其他通路,本研究尚未探究,这将是下一步研究的重要内容之一。