紫陀螺菌液体深层发酵培养基的筛选

谭爱华 刘 璐 肖 倩 李方桥

（1湖北三峡职业技术学院，湖北 宜昌 443000；2三峡大学生物与制药学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室，湖北 宜昌 430002）

紫陀螺菌Gomphus purpuraceus，属担子菌亚门Basidiomycotina、非褶菌目Aphyllophorales、陀螺菌科Gomphaceae、陀螺菌属Gomphus，是生长在阔叶混交林地的一种外生菌根菌，常在夏秋季形成子实体[1]。1999年7月，笔者首次在三峡地区西陵峡河谷区发现紫陀螺菌[2]，后研究发现紫陀螺菌在甘肃、云南、贵州、四川等部分地区也有生长[2]。紫陀螺菌鲜菇肉质脆嫩，味道鲜美，营养丰富，干制后香味独特，是一种极具营养价值的珍稀食用菌[3]。紫陀螺菌含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、糖类以及微量元素等[3-8]，具有较高的研究价值和开发潜力。紫陀螺菌目前尚未实现人工栽培，只能采集野生资源，而紫陀螺菌需要与松科或壳斗科等木本植物共生，且需共生宿主植物长大到一定年限后才能稳定出菇，产量也极易受降雨量等环境因素的影响[1-9]。为有效开发利用紫陀螺菌，采用液体深层发酵的方式在较短时间内获得较多的菌丝体是一种更加便捷的方法。因此，笔者在紫陀螺菌生态研究[9]、菌种分离[10-12]的基础上，进行大量的培养基筛选试验[2，13-14]。为筛选获得最佳液体深层发酵配方，笔者主要采用均匀设计法，以紫陀螺菌的菌丝体生物量为指标，并用高效液相色谱分析最佳配方和初始配方的发酵液产物丰富度，进一步证实最佳配方的有效性，为紫陀螺菌进一步研究提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验菌株及培养基

供试菌株为Gp01，由采自西陵峡河谷区的野生子实体分离纯化所得，保藏于中国典型培养物保藏中心（武汉），保藏号为CCTCCM2021376。

斜面及平板培养基配方：去皮马铃薯250 g，琼脂16 g，葡萄糖20 g，蛋白胨9 g，磷酸二氢钾0.5 g，水1 000 mL。种用液体培养基配方：去皮马铃薯250 g，葡萄糖20 g，蛋白胨9 g，磷酸二氢钾0.5 g，水1 000 mL。

1.2 试验方法

1.2.1 液体深层发酵培养基配方筛选试验设计

将斜面菌种接种至平板培养基上，于23 ℃恒温培养至菌落直径为3～4 cm 时备用。配制液体培养基，分装于500 mL 三角瓶，并于121 ℃、0.11 MPa 压力下灭菌30 min 后冷却备用。将经活化的平板菌落外缘菌丝切碎后直接接入三角瓶中，置于磁力搅拌器上，转速为900 r/min、温度为23 ℃，恒温振荡培养直至菌液浓稠，在菌种转接前24 h 再利用1 500 r/min的转速将菌液搅碎呈均匀的菌浆备用。

选取马铃薯X1、葡萄糖X2、蛋白胨X3、磷酸二氢钾X4、磷酸氢二钾X5、硫酸镁X6作为均匀设计的参试因素，每因素设7 个水平（表1），以菌丝体生物量为目标函数（Y），采用均匀设计法U7（76）筛选深层发酵培养基配方[15-16]。

表1 试验因素和水平表单位：g/L

将去皮的马铃薯切块、煮沸20 min 后用六层纱布过滤，取其滤液，按试验设计配制培养基。使用250 mL 三角瓶各自分装100 mL，每个处理3 个重复，于121 ℃、0.11 MPa 压力下灭菌30 min 后冷却备用。吸取液体菌种（菌浆）8 mL 分别接入摇瓶中。将摇瓶置于23 ℃、150 r/min 的恒温振荡器中连续振荡培养15 d。

深层发酵后的发酵液过滤（孔径为0.178 μm），滤出的菌丝体用纯水冲洗2～3 遍后，取出置于培养皿中，于40 ℃的烘箱内烘干至恒重，精确称量后计算干重，再换算成每1 000 mL发酵液中的菌丝体干重。

1.2.2 高效液相色谱（HPLC）法验证优化

将筛选出的最佳液体深层发酵培养基和初始种用液体培养基进行验证，每个培养基3次重复，接种方法、接种量、培养方法同1.2.1。

用纱布分别过滤发酵液中的菌丝体后，每个培养基发酵液各取20 mL，经乙酸乙酯萃取3 次，使用旋转蒸发仪减压浓缩得到浸提物样本。

每个浸提物样本分别用0.5 mL 70%乙腈溶解，经0.22 mm 滤膜过滤后上样分析。HPLC 分析色谱柱为YMC-Pack ODS-A 系列C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.1%冰乙酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱（0-40 min，B/A：10%→90%；40-55 min，B/A：90%→100%；55-75 min，B/A：100%→100%），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长为254 nm，进样量10 μL。

1.3 数据分析

采用DPS V7.05对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 最佳配方的筛选结果

2.1.1 结果统计及回归方程的构建与分析

培养后的发酵液较浓稠，其中菌丝体呈现絮状、条状、片状、球状等形态。各处理获得的菌丝体生物量见表2。由表2 可知，水平7 即配方7 的菌丝体生物量最高。

表2 试验设计及生物量单位：g/L

用DPS v7.05 对数据进行二次多项式逐步回归分析所得回归方程为：

对回归方程进行检验，计算得出相关系数R2等于1.000 0，F值为99 999.850 0，剩余标准差SSE等于0.005 4。回归方程的显著性水平P值为0.002 4，P值小于0.01，达到0.01 的极显著水平，结果表明该方程可信度较高。

2.1.2 回归项的回归系数t检验

由表3 可知，方程中X2（葡萄糖）的P值为0.000 1、X（3蛋白胨）的平方项P值为0.000 1、X（1马铃薯）与X（5磷酸氢二钾）的P值为0.000 7、X（2葡萄糖）与X（3蛋白胨）的P值为0.002 4、X（3蛋白胨）与X5（磷酸氢二钾）的P值为0.000 1，可看出上述各项P值均小于0.01，全部达到极显著水平，说明方程中引入的各项因素对菌丝体生物量均有影响。

表3 各项回归项的回归系数检验结果

由表4 可知，各水平的观测值与拟合值的数值差极小，另外，试验组的最大拟合误差绝对值也仅为0.0043，说明通过回归方程拟合的菌丝体生物量数值与实际的试验数值基本一致，也可进一步证明上述构建的回归方程的准确性。

表4 各水平的观测值、拟合值和拟合误差

2.1.3 配方优化

通过DPS v7.05进行回归分析，并通过数学模型得到紫陀螺菌液体深层发酵培养基的理论最优组合，将其与组间最优水平（配方7）进行对比验证（表5），获得理论最优配方，且菌丝体生物量为17.357 4 g/L。

表5 配方优化验证单位：g/L

2.2 发酵液成分分析

由图1 可知，最优培养发酵的色谱图和初始种用液体培养基发酵的色谱图完全不同，且前者比后者具有更多的出峰点。结果表明，最优培养基的紫陀螺菌发酵液成分比初始种用液体培养基配方更丰富，从而得出构建的理论最优配方可使紫陀螺菌发酵得更充分。

图1 紫陀螺菌发酵液的HPLC图谱（波长为254 nm）

3 小结与讨论

试验构建紫陀螺菌的最佳液体深层发酵培养基配方：去皮马铃薯298 g，葡萄糖30 g，蛋白胨12 g，磷酸二氢钾1.2 g，硫酸镁0.2 g，水1 000 mL。再通过高效液相色谱法对比分析最佳配方和初始种用配方的发酵液成分，得出最佳配方紫陀螺菌发酵液能产生更多更丰富的发酵成分。这为紫陀螺菌在医药上应用提供了一些理论支撑，今后可进一步研究人工驯化紫陀螺菌的深层发酵及其产物。