迷迭香酸通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制喉癌细胞的增殖和迁移

延 青,杨花荣,王娜娜

（延安大学附属医院鼻咽喉科，陕西 延安 716000）

喉癌是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，主要病理类型为喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）。由于该病早期通常无明显临床症状，大多数LSCC 患者就诊时已处于具有高侵袭性的晚期阶段[1]。尽管手术和放疗可以延长LSCC 患者的生存期，但仍有约30%的患者出现复发或转移。肿瘤侵袭转移是导致LSCC 患者生存率低的主要原因[2-3]。因此，迫切需要寻找更有效的治疗策略。迷迭香酸（rosmarinic acid,RA）是一种常见于唇形科植物中的酚类化合物[4]，具有抗癌活性，能有效抑制肝癌[5]、乳腺癌[6]细胞的增殖和迁移，还可以调节与细胞增殖、侵袭相关的信号通路。据报道，RA 可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制肝癌细胞的增殖和侵袭[7]。但RA 是否能通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路抑制LSCC细胞恶性进展仍不清楚。因此，本研究主要通过观察RA对LSCC细胞增殖和迁移的影响，分析其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 药物及细胞

RA（批号：M-024）购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度≥98%。人LSCC细胞系Hep-2（批号：CCL-23）购自美国ATCC 细胞库；人LSCC 细胞系TU686（批号：A3079）购自上海酶研生物科技有限公司。

1.2 主要试剂及仪器

CCK-8 试剂盒（批号：210508）购自北京索莱宝科技有限公司；细胞总蛋白提取试剂盒（批号：20200815）购自上海雅酶生物医药科技有限公司；BCA试剂盒（批号：210317）购自上海碧云天生物公司；Ki-67、MMP-2、MMP-9、GAPDH 兔多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗（批号：20210506、20210814、20210913、20210425、20211004）均购自英国Abcam 公司；PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR（批号：210807、210705、210413、210610、210920、210924）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；PI3K/AKT/mTOR 信号通路激活剂胰岛素生长因子1（insulin-like growth factor 1,IGF-1）重组蛋白（批号：211104）购自美国Med Chem Express公司。

细胞培养箱（型号：LW-80A-Ⅲ）购自上海利闻科学仪器有限公司，酶标仪（型号：BIO-RAD-550）购自北京京科瑞达科技有限公司。

1.3 细胞培养、分组与形态观察

将Hep-2 和TU686 细胞置于含有10% FBS 与90%DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2条件下进行常规传代培养，每3 d 更换1 次培养基。取对数生长期的Hep-2和TU686 细胞，于添加20 μmol/L RA、50 μmol/L RA、100 μmol/L RA、10 nmol/mL IGF-1、10 nmol/mL IGF-1+100 μmol/L RA 的培养基中培养48 h[7]，分别作为低剂量组、中剂量组、高剂量组、IGF-1 组、IGF-1+RA 组，另设置对照组（正常培养的对数生长期的Hep-2 和TU686细胞）。培养48 h后，使用倒置显微镜观察各组Hep-2和TU686细胞形态，并拍照。

1.4 检测细胞增殖能力

将各组Hep-2 和TU686 细胞以2×105个/孔接种到24 孔板中，每组分别设置6 个复孔，按照1.3 项下方法分组处理48 h，然后向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，5% CO2、37 ℃孵育2 h，利用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度。

1.5 检测细胞迁移能力

取对数生长期的各组Hep-2 和TU686 细胞，消化重悬。细胞以2×105个/孔的密度培养于24 孔板中，待细胞贴壁后，每孔划出相等距离线条，于37 ℃、5% CO2的条件下持续培养48 h，倒置显微镜下观察划痕愈合情况并拍照，测量划痕距离，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（0 h的划痕距离-48 h的划痕距离）/0 h的划痕距离×100%。

1.6 检测蛋白表达水平

使用RIPA 裂解缓冲液提取细胞中总蛋白。通过BCA 试剂盒测定蛋白浓度，平衡蛋白浓度后，使用10% SDS-PAGE 进行电泳分离获得蛋白，并转至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h。随后，加入一抗PI3K（1∶3 000）、AKT（1∶3 000）、mTOR（1∶1 000）、p-PI3K（1∶3 000）、p-AKT（1∶3 000）、p-mTOR（1∶1 000）、Ki-67（1∶1 000）、MMP-2（1∶2 500）、MMP-9（1∶2 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃下孵育过夜，再加入羊抗兔IgG 二抗（1∶2 000）在室温下孵育2 h。使用ECL 化学发光试剂盒将蛋白可视化，通过Image J软件对目标条带的灰度值进行分析。

1.7 统计学分析

使用SPSS 25.0 软件对实验所得数据进行统计学分析，结果均以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Hep-2和TU686细胞形态

与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组Hep-2 和TU686 细胞数量均减少，细胞严重皱缩，并有大量细胞碎片出现，且RA 浓度越高，Hep-2 和TU686细胞数量越少；而IGF-1组Hep-2和TU686细胞数量增多，细胞形态无明显改变；与高剂量组比较，IGF-1+RA组Hep-2 和TU686 细胞数量增多，贴壁细胞数更多，见图1。

图1 各组Hep-2和TU686细胞形态（×400）

2.2 各组Hep-2和TU686细胞增殖能力

与对照组比较，在48 h 时低剂量组、中剂量组、高剂量组Hep-2和TU686细胞OD450值显著降低（P＜0.05），而IGF-1 组Hep-2 和TU686 细胞OD450值显著升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，在48 h 时IGF-1+RA 组Hep-2和TU686细胞OD450值显著升高（P＜0.05），见图2。

图2 各组Hep-2和TU686细胞的增殖活性

2.3 各组Hep-2和TU686细胞迁移能力

与对照组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组Hep-2和TU686细胞划痕愈合率显著降低（P＜0.05），而IGF-1 组Hep-2 和TU686 细胞划痕愈合率显著升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，IGF-1+RA 组Hep-2 和TU686细胞划痕愈合率显著升高（P＜0.05），见图3。

图3 各组Hep-2和TU686细胞愈合率比较

2.4 各组Hep-2 和TU686 细胞中增殖、迁移相关蛋白表达情况

与对照组比较，中剂量组、高剂量组Hep-2 和TU686 细胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而IGF-1 组Hep-2 和TU686 细胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，IGF-1+RA 组Hep-2 和TU686 细胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图4～5。

图4 各组Hep-2细胞中增殖、迁移蛋白表达

图5 各组TU686细胞中增殖、迁移蛋白表达

2.5 各组Hep-2 和TU686 细胞中PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白表达情况

与对照组比较，中剂量组、高剂量组Hep-2 和TU686细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平显著降低（P＜0.05），而IGF-1 组Hep-2 和TU686 细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 水平显著升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，IGF-1+RA组Hep-2和TU686 细胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平显著升高（P＜0.05），见图6～7。

图6 各组Hep-2细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白

图7 各组TU686细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白

3 讨论

LSCC发展到晚期时，较差的预后和有限的治疗方式对患者生命造成严重威胁[8-10]。因此，寻找安全、有效、低毒的治疗药物具有重要意义。RA 作为一种天然活性成分，具有广泛的生物学活性，如抗炎、抗氧化、抗感染和保肝[11-12]。此外，RA 对多种恶性肿瘤（如乳腺癌[6]、肝癌[7]、结直肠癌[13]和黑色素瘤[14]）的恶性进展具有抑制作用。本研究结果显示，RA 可抑制Hep-2和TU686 细胞增殖、迁移，这与上述研究一致。有研究证实Ki-67 在癌组织中高表达，参与癌症的发展进程[15]；MMP-2、MMP-9 在癌细胞中高表达，能有效促进癌细胞的迁移和侵袭，导致癌症恶化[16]。本研究结果显示，RA能降低Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白水平，表明RA 能够有效抑制LSCC 细胞的增殖和迁移，提示RA可能是LSCC的潜在治疗药物。

PI3K/AKT/mTOR 信号通路在癌症进展中具有关键作用，可调控多种过程，包括新陈代谢、细胞生长、存活、迁移和分化[17-18]。研究显示，PI3K/AKT/mTOR 信号通路的过度激活，参与多种癌症进展[19-20]。因此，PI3K/AKT/mTOR 信号通路被认为是治疗癌症的重要靶点。有研究报道，RA 在体内外抑制肝癌细胞增殖、侵袭和肿瘤生长的作用与抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活密切相关[7]。本研究发现，中、高剂量的RA可显著降低Hep-2和TU686细胞中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 的蛋白表达水平，表明RA 可抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的激活。因此，可以推测RA 对LSCC细胞恶性生物学行为的抑制作用可能与抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路有关。为了验证这一机制，本研究在RA 处理的基础上，使用PI3K/AKT/mTOR 激活剂IGF-1 进行干预，结果显示，IGF-1 可以有效减轻RA 对LSCC 细胞恶性生物学行为的抑制作用。提示RA 对LSCC 细胞增殖、迁移的抑制作用可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。

综上所述，RA 可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路，从而抑制LSCC 细胞增殖、迁移。本研究进一步明确了RA 发挥抗LSCC 作用的分子机制，为RA 的应用提供理论依据，表明RA 有望成为LSCC 的潜在治疗药物。但需要进一步的体内实验研究来验证RA 对LSCC的抗癌作用。