lncRNA HOTAIR 促椎间盘髓核细胞凋亡的机制研究

艾力夏提·艾热提,马志刚,李洪伟

（新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心脊柱一科，新疆 乌鲁木齐 830000）

椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）是下腰痛最常见的原因之一，表现为细胞外基质的退化、细胞凋亡、炎症反应增加[1]。当前IDD的治疗主要为缓解疼痛和控制症状，较少干扰其病理生理过程，虽然已有一些缓解轻度和中度IDD的临床策略，但仍需进一步探讨[2-3]。因此，深入研究IDD的发病机制对研发新型治疗方法有帮助。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸，且无编码蛋白功能的RNA。越来越多的证据表明，lncRNA在人类退行性髓核组织中存在差异表达，并可能在调节IDD的进展中发挥关键作用[4-5]。有研究发现，核苷酸结合寡聚结构域样受体家族Pyrin域蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing protein 3,NLRP3）在IDD中表达明显增高，且与椎间盘退变程度呈正相关，而且IDD 的髓核细胞中NLRP3 炎症小体被激活[6-8]。另外，已有研究表明，lncRNA HOX 转录反义RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR）与NLRP3炎症小体的激活有关[9]。lncRNA HOTAIR 可通过内源竞争性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）竞争机制来控制微小RNA（microRNA,miR）-22 的表达和功能[10-11]，而且lncRNA HOTAIR 还可以调控IDD 的进展[12]。然而，lncRNA HOTAIR 在IDD 中对髓核细胞的炎症小体和细胞凋亡的具体作用尚不清楚。故本研究探讨了lncRNA HOTAIR 对椎间盘髓核细胞中炎症小体激活的调节作用和机制。

1 材料与方法

1.1 人椎间盘髓核细胞系培养

人椎间盘髓核细胞系（human intervertebral disc nucleus pulposus cell line,HNPC）购自武汉普诺赛生物科技有限公司。HNPC 细胞在含有10%胎牛血清（美国GIBCO 公司）、100 mg/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素的杜氏改良培养基中培养，并置于37 ℃的湿润培养箱[95%(V/V)空气和5%(V/V) CO2]中培养，培养基每隔2 d 更换1 次。细胞每隔3 d 传代1 次，将传代2 次后的对数生长期细胞用于后续实验。

1.2 细胞的分组与处理

用晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGE）诱导HNPC 细胞退变。首先将HNPC 细胞分为AGE（200 μg/mL,上海远慕生物有限公司）处理组（AGE 组）和对照组（与AGE 等体积的生理盐水处理细胞，Ctrl 组）。其次，将HNPC 细胞分为miR-22 的拟似物（20 μg/mL，北京生工生物技术公司）组（mimic组）、mimic 的阴性对照（20 μg/mL，北京生工生物技术公司）组（mimic-NC 组）、lncRNA HOTAIR 过表达质粒（10 μg/mL，上海吉玛公司）组（HOTAIR 组）、过表达质粒的空载体（10 μg/mL，上海吉玛公司）组（Vector 组）、10 μg/mL HOTAIR 联合20 μg/mL mimic 处理组（HOTAIR+mimic组）、10 μg/mL HOTAIR联合50 μg/mL NLRP3 抑制剂mcc950 处理组（HOTAIR+mcc950 组）。各组细胞均处理24 h用于后续实验。

1.3 流式细胞术检测HNPC细胞的凋亡率

用Annexin V-FITC凋亡试剂盒（美国Sigma公司）评估AGE 组、Ctrl 组、HOTAIR 组以及Vector 组细胞凋亡率。各组HNPC 细胞在结合缓冲液中洗涤2 次后，以500 g离心5 min。然后置于100 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI的1×结合缓冲液中避光培养。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 Western blot检测炎症小体蛋白标志物

检测AGE 组、Ctrl 组、HOTAIR 组、Vector 组、HOTAIR+mimic 组、HOTAIR+mcc950 组中炎症小体相关蛋白NLRP3、Caspase1、含半胱天冬酶激活和募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain,ASC）的表达。用RIPA 裂解缓冲液裂解细胞提取总蛋白。用二喹啉甲酸试剂盒测定蛋白浓度。此外，使用12% SDS-PAGE凝胶分离蛋白，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用5%的脱脂牛奶封闭2 h，然后在4 ℃下与一抗（均购于美国Abcam公司）孵育10 h。免疫复合物用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体（1∶5 000）孵育。使用Western-Light化学发光检测系统捕获蛋白信号表达。所有实验均重复3 次。抗体为NLRP3（1∶500）、Caspase1（1∶1 000）、ASC（1∶600）。

1.5 qRT-PCR 法检测lncRNA HOTAIR 和miR-22 的表达

根据试剂盒说明书，使用TRIzol 试剂（美国Invitrogen 公司）和RNeasy mini kit（美国Qiagen 公司）从各组HNPC 细胞中提取总RNA 或者总miRNA。通过分光光度法测定总RNA 或者总miRNA 的浓度和纯度，并使用PrimeScript RT 逆转录酶试剂盒（日本Takara公司）按照说明书合成互补DNA。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒（日本Takara公司）和StepOnePlus实时PCR系统（美国Applied Biosystems）进行qRT-PCR 分析。lncRNA HOTAIR 表达以GAPDH 为内参，miR-22 表达以U6 为内参，用2-ΔΔCt法测定基因的相对表达量。目的基因引物由上海生工生物技术有限公司设计。引物序列：lncRNA HOTAIR 正向 5＇- CCTTAT AAGCTCATCGGAGCA-3＇，反向5＇-CATTTCTGGG TGGTTCCTTT-3＇；miR-22 正向5＇-GGTTAAGCTGCC AGTTGAA-3＇，反向5＇-CCAGTGCGTGTCGTGGAGT-3＇；GAPDH 正向5＇-CTCACTGCTACATCCAGTACAC-3＇，反向5＇-CCTGCCTACCATGTTTACCG-3＇；U6 正向5＇-CTCGCTTCGGCAGCACA-3＇，反向5＇-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3＇。

1.6 双荧光素酶报告实验

通过双荧光素酶报告实验检测lncRNA HOTAIR与miR-22 以及miR-22 与NLRP3 的3'-UTR 的结合作用。通过PCR 扩增HOTAIR 中包含预测miR-22 结合位点的cDNA 片段。然后将结合位点的假定序列克隆到pGL3 双荧光素酶miRNA-基因表达载体（美国Promega 公司）中，构建报告载体pGL3-HOTAIR-wild-type（WT-lncRNA HOTAIR）。另外，使HOTAIR 基因中miR-22 的结合位点发生突变，并命名为pGL3-HOTAIR-mut（MUT-lncRNA HOTAIR）。随后，根据说明书，使用Lipofectamine 2000 将1 μg WT-lncRNA HOTAIR 或1 μg MUT-lncRNA HOTAIR 分别与mimic转染的HNPC 细胞（5×104个/孔）共转染（mimic 组），或使用Lipofectamine 2000 将1 μg WT-lncRNA HOTAIR或1 μg MUT-lncRNA HOTAIR 分别与mimic-NC 转染的HNPC 细胞（5×104个/孔）共转染（mimic-NC 组）。双荧光素酶报告系统（美国Promega 公司）检测荧光素酶活性。

另外，与上述方案一致，构建报告载体pGL3-NLRP3-3'UTR-wild-type （WT-NLRP3-3'UTR） 。 使NLRP3-3'UTR中miR-22的结合位点发生突变，并命名为pGL3-NLRP3-3'UTR-mut（MUT-NLRP3-3'UTR）。随后，根据说明书，使用Lipofectamine 2000 将1 μg WTNLRP3-3'UTR 或1 μg MUT-NLRP3-3'UTR 分别与mimic 转染的HNPC 细胞（5×104个/孔）共转染（mimic组），或使用Lipofectamine 2000 将质粒1 μg WTNLRP3-3'UTR 或1 μg MUT-NLRP3-3'UTR 分别与mimic-NC 转染的HNPC 细胞（5×104个/孔）共转染（mimic-NC 组）。双荧光素酶报告系统（美国Promega公司）检测荧光素酶活性。

1.7 Hoechst 33342染色检测HNPC细胞的凋亡率

将Vector 组、HOTAIR 组、Ctrl 组、HOTAIR+mimic组、HOTAIR+mcc950 组HNPC 细胞过夜培养。用PBS轻轻冲洗细胞，同时加入0.5 mL Hoechst 33342（美国Thermo Fisher 公司）和PI（美国Invitrogen 公司）工作液。将细胞置于室温培养箱中培养15 min。PBS 冲洗后，用荧光显微镜观察分析，统计图中HNPC细胞的凋亡数。

1.8 统计学分析

使用GraphPad PRISM 5.01 进行数据录入和统计学分析，正态分布的数据以均数±标准差（）表示。2组间比较采用Studentt检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准为α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 髓核细胞中lncRNA HOTAIR、miR-22、NLRP3 的表达

使用200 μg/mL 的AGE 诱导髓核细胞退变。与Ctrl 组比较，AGE 组细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），而且AGE 组NLRP3、ASC、Caspase1 的表达均上调（P＜0.05）。与Ctrl 组比较，AGE 组髓核细胞中lncRNA HOTAIR 的表达上调（P＜0.05），而miR-22下调（P＜0.05）。双荧光素酶报告实验检测发现，lncRNA HOTAIR 可直接结合miR-22，且miR-22 可与NLRP3的3'UTR结合，见图1。

图1 lncRNA HOTAIR、miR-22、NLRP3炎症小体在AGE诱导的髓核细胞退变中的表达

2.2 过表达lncRNA HOTAIR 促进炎症小体的激活和细胞凋亡

与Vector 组比较，HOTAIR 组的lncRNA HOTAIR表达显著增加（P＜0.05）。与Vector 组比较，HOTAIR组NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均上调（P＜0.05），且髓核细胞的凋亡率显著升高（P＜0.05），miR-22表达显著降低（P＜0.05），见图2。

图2 lncRNA HOTAIR 过表达对NLRP3炎症小体和髓核细胞凋亡的影响

2.3 lncRNA HOTAIR 通过抑制miR-22 激活NLRP3促进的细胞凋亡

与Ctrl 组比较，HOTAIR 组细胞凋亡数明显增加（P＜0.05）；与HOTAIR 组比较，HOTAIR+mimic 组及HOTAIR+mcc950 组细胞凋亡数均显著减少（P＜0.05），见图3。

图3 lncRNA HOTAIR 通过抑制miR-22激活NLRP3促进的细胞凋亡

2.4 lncRNA HOTAIR 通过抑制miR-22 激活NLRP3介导的炎症小体

与Ctrl 组比较，HOTAIR 组lncRNA HOTAIR 以及NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均上调（P＜0.05），而miR-22 的表达显著下调（P＜0.05）。与HOTAIR 组比较，HOTAIR+mimic 组lncRNA HOTAIR 的表达无显著变化（P＞0.05），miR-22 的表达显著上调（P＜0.05），而NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均显著下调（P＜0.05）。与HOTAIR 组比较，HOTAIR+mcc950 组lncRNA HOTAIR 和miR-22 表达均无显著变化（P＞0.05），而NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均显著下调（P＜0.05），见图4。

图4 髓核细胞中lncRNA HOTAIR、miR-22以及NLRP3炎症小体标志物的表达

3 讨论

IDD 是一种常见的退行性疾病，lncRNA 在其发病机制中起到重要作用[10-13]。2014年，Wan等[14]首次报道了人类IDD 中lncRNA 的表达谱，与健康人群相比，IDD 人群中lncRNA HOTAIR（NR_003716）的表达差异显著。本研究发现，在AGE 诱导髓核细胞退变过程中，lncRNA HOTAIR 表达显著上调，并且进一步证明其具有促进HNPC 细胞凋亡的能力。此外，本研究发现，lncRNA HOTAIR 通过与miR-22 和靶基因NLRP3的直接靶向结合，调控NLRP3 炎症小体的激活。这些发现为以lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴作为IDD的治疗靶点提供了新线索。

先前的研究表明，ceRNA 调控网络在IDD 中具有重要作用[15-19]。lncRNA HOTAIR 可通过与miR-34a、miR-22等miRNAs相互作用来调控髓核细胞凋亡[20-21]，且miR-22 是一种被充分证明受ceRNA 网络调控并参与介导多种细胞过程的miRNA[22]，其可促进HNPC 细胞增殖，抑制HNPC 细胞的退行性改变并减缓细胞衰老[23]。本研究证实了miR-22 在AGE 诱导后的HNPC细胞中显著降低，而且过表达lncRNA HOTAIR 显著抑制了miR-22 的表达，表明lncRNA HOTAIR 可以负向调控miR-22。有趣的是，我们进一步研究发现，lncRNA HOTAIR 与miR-22 直接靶向结合。此外，lncRNA HOTAIR 过表达可以促进HNPC 细胞凋亡并抑制miR-22 的表达，过表达miR-22 后明显逆转了这种促进作用，表明HNPC 细胞凋亡受lncRNA HOTAIR/miR-22轴的调控。

另外，本研究进一步发现，miR-22 与NLRP3 直接靶向结合。AGE 诱导后NLRP3炎症小体明显被激活，且当lncRNA HOTAIR 过表达后可以显著上调NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白，从而促进NLRP3 炎症小体激活。当mcc950 抑制NLRP3 后，明显逆转了lncRNA HOTAIR 对凋亡和炎症小体的促进作用。过表达miR-22 后明显逆转了这种促进作用，表明HNPC 的细胞凋亡和炎症小体都受lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3轴的调控。

尽管在体外实验中观察到了lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴在促进HNPC 细胞凋亡和炎症小体激活中的重要作用，但仍需要进一步研究来验证这种调控机制在体内是否能逆转IDD 的发生和发展。例如，开展动物模型实验和临床研究来评估针对lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴的治疗策略是否能够有效改善IDD患者的病情。

综上所述，lncRNA HOTAIR 通过调控miR-22 和NLRP3 的表达，参与了椎间盘髓核细胞凋亡和炎症小体的激活。本研究表明，以lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴作为IDD 的治疗靶点非常有前景，可用于IDD治疗的候选药物的研究中。