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lncRNA HOTAIR 促椎间盘髓核细胞凋亡的机制研究

2023-10-03艾力夏提艾热提马志刚李洪伟

局解手术学杂志 2023年9期
关键词:小体荧光素酶椎间盘

艾力夏提·艾热提,马志刚,李洪伟

(新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心脊柱一科,新疆 乌鲁木齐 830000)

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是下腰痛最常见的原因之一,表现为细胞外基质的退化、细胞凋亡、炎症反应增加[1]。当前IDD的治疗主要为缓解疼痛和控制症状,较少干扰其病理生理过程,虽然已有一些缓解轻度和中度IDD的临床策略,但仍需进一步探讨[2-3]。因此,深入研究IDD的发病机制对研发新型治疗方法有帮助。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸,且无编码蛋白功能的RNA。越来越多的证据表明,lncRNA在人类退行性髓核组织中存在差异表达,并可能在调节IDD的进展中发挥关键作用[4-5]。有研究发现,核苷酸结合寡聚结构域样受体家族Pyrin域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)在IDD中表达明显增高,且与椎间盘退变程度呈正相关,而且IDD 的髓核细胞中NLRP3 炎症小体被激活[6-8]。另外,已有研究表明,lncRNA HOX 转录反义RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR)与NLRP3炎症小体的激活有关[9]。lncRNA HOTAIR 可通过内源竞争性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)竞争机制来控制微小RNA(microRNA,miR)-22 的表达和功能[10-11],而且lncRNA HOTAIR 还可以调控IDD 的进展[12]。然而,lncRNA HOTAIR 在IDD 中对髓核细胞的炎症小体和细胞凋亡的具体作用尚不清楚。故本研究探讨了lncRNA HOTAIR 对椎间盘髓核细胞中炎症小体激活的调节作用和机制。

1 材料与方法

1.1 人椎间盘髓核细胞系培养

人椎间盘髓核细胞系(human intervertebral disc nucleus pulposus cell line,HNPC)购自武汉普诺赛生物科技有限公司。HNPC 细胞在含有10%胎牛血清(美国GIBCO 公司)、100 mg/mL 链霉素和100 U/mL 青霉素的杜氏改良培养基中培养,并置于37 ℃的湿润培养箱[95%(V/V)空气和5%(V/V) CO2]中培养,培养基每隔2 d 更换1 次。细胞每隔3 d 传代1 次,将传代2 次后的对数生长期细胞用于后续实验。

1.2 细胞的分组与处理

用晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGE)诱导HNPC 细胞退变。首先将HNPC 细胞分为AGE(200 μg/mL,上海远慕生物有限公司)处理组(AGE 组)和对照组(与AGE 等体积的生理盐水处理细胞,Ctrl 组)。其次,将HNPC 细胞分为miR-22 的拟似物(20 μg/mL,北京生工生物技术公司)组(mimic组)、mimic 的阴性对照(20 μg/mL,北京生工生物技术公司)组(mimic-NC 组)、lncRNA HOTAIR 过表达质粒(10 μg/mL,上海吉玛公司)组(HOTAIR 组)、过表达质粒的空载体(10 μg/mL,上海吉玛公司)组(Vector 组)、10 μg/mL HOTAIR 联合20 μg/mL mimic 处理组(HOTAIR+mimic组)、10 μg/mL HOTAIR联合50 μg/mL NLRP3 抑制剂mcc950 处理组(HOTAIR+mcc950 组)。各组细胞均处理24 h用于后续实验。

1.3 流式细胞术检测HNPC细胞的凋亡率

用Annexin V-FITC凋亡试剂盒(美国Sigma公司)评估AGE 组、Ctrl 组、HOTAIR 组以及Vector 组细胞凋亡率。各组HNPC 细胞在结合缓冲液中洗涤2 次后,以500 g离心5 min。然后置于100 μL Annexin V-FITC 和10 μL PI的1×结合缓冲液中避光培养。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 Western blot检测炎症小体蛋白标志物

检测AGE 组、Ctrl 组、HOTAIR 组、Vector 组、HOTAIR+mimic 组、HOTAIR+mcc950 组中炎症小体相关蛋白NLRP3、Caspase1、含半胱天冬酶激活和募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain,ASC)的表达。用RIPA 裂解缓冲液裂解细胞提取总蛋白。用二喹啉甲酸试剂盒测定蛋白浓度。此外,使用12% SDS-PAGE凝胶分离蛋白,并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜用5%的脱脂牛奶封闭2 h,然后在4 ℃下与一抗(均购于美国Abcam公司)孵育10 h。免疫复合物用辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG抗体(1∶5 000)孵育。使用Western-Light化学发光检测系统捕获蛋白信号表达。所有实验均重复3 次。抗体为NLRP3(1∶500)、Caspase1(1∶1 000)、ASC(1∶600)。

1.5 qRT-PCR 法检测lncRNA HOTAIR 和miR-22 的表达

根据试剂盒说明书,使用TRIzol 试剂(美国Invitrogen 公司)和RNeasy mini kit(美国Qiagen 公司)从各组HNPC 细胞中提取总RNA 或者总miRNA。通过分光光度法测定总RNA 或者总miRNA 的浓度和纯度,并使用PrimeScript RT 逆转录酶试剂盒(日本Takara公司)按照说明书合成互补DNA。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(日本Takara公司)和StepOnePlus实时PCR系统(美国Applied Biosystems)进行qRT-PCR 分析。lncRNA HOTAIR 表达以GAPDH 为内参,miR-22 表达以U6 为内参,用2-ΔΔCt法测定基因的相对表达量。目的基因引物由上海生工生物技术有限公司设计。引物序列:lncRNA HOTAIR 正向 5'- CCTTAT AAGCTCATCGGAGCA-3',反向5'-CATTTCTGGG TGGTTCCTTT-3';miR-22 正向5'-GGTTAAGCTGCC AGTTGAA-3',反向5'-CCAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';GAPDH 正向5'-CTCACTGCTACATCCAGTACAC-3',反向5'-CCTGCCTACCATGTTTACCG-3';U6 正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向5'-AACGCTT CACGAATTTGCGT-3'。

1.6 双荧光素酶报告实验

通过双荧光素酶报告实验检测lncRNA HOTAIR与miR-22 以及miR-22 与NLRP3 的3'-UTR 的结合作用。通过PCR 扩增HOTAIR 中包含预测miR-22 结合位点的cDNA 片段。然后将结合位点的假定序列克隆到pGL3 双荧光素酶miRNA-基因表达载体(美国Promega 公司)中,构建报告载体pGL3-HOTAIR-wild-type(WT-lncRNA HOTAIR)。另外,使HOTAIR 基因中miR-22 的结合位点发生突变,并命名为pGL3-HOTAIR-mut(MUT-lncRNA HOTAIR)。随后,根据说明书,使用Lipofectamine 2000 将1 μg WT-lncRNA HOTAIR 或1 μg MUT-lncRNA HOTAIR 分别与mimic转染的HNPC 细胞(5×104个/孔)共转染(mimic 组),或使用Lipofectamine 2000 将1 μg WT-lncRNA HOTAIR或1 μg MUT-lncRNA HOTAIR 分别与mimic-NC 转染的HNPC 细胞(5×104个/孔)共转染(mimic-NC 组)。双荧光素酶报告系统(美国Promega 公司)检测荧光素酶活性。

另外,与上述方案一致,构建报告载体pGL3-NLRP3-3'UTR-wild-type (WT-NLRP3-3'UTR) 。 使NLRP3-3'UTR中miR-22的结合位点发生突变,并命名为pGL3-NLRP3-3'UTR-mut(MUT-NLRP3-3'UTR)。随后,根据说明书,使用Lipofectamine 2000 将1 μg WTNLRP3-3'UTR 或1 μg MUT-NLRP3-3'UTR 分别与mimic 转染的HNPC 细胞(5×104个/孔)共转染(mimic组),或使用Lipofectamine 2000 将质粒1 μg WTNLRP3-3'UTR 或1 μg MUT-NLRP3-3'UTR 分别与mimic-NC 转染的HNPC 细胞(5×104个/孔)共转染(mimic-NC 组)。双荧光素酶报告系统(美国Promega公司)检测荧光素酶活性。

1.7 Hoechst 33342染色检测HNPC细胞的凋亡率

将Vector 组、HOTAIR 组、Ctrl 组、HOTAIR+mimic组、HOTAIR+mcc950 组HNPC 细胞过夜培养。用PBS轻轻冲洗细胞,同时加入0.5 mL Hoechst 33342(美国Thermo Fisher 公司)和PI(美国Invitrogen 公司)工作液。将细胞置于室温培养箱中培养15 min。PBS 冲洗后,用荧光显微镜观察分析,统计图中HNPC细胞的凋亡数。

1.8 统计学分析

使用GraphPad PRISM 5.01 进行数据录入和统计学分析,正态分布的数据以均数±标准差()表示。2组间比较采用Studentt检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准为α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 髓核细胞中lncRNA HOTAIR、miR-22、NLRP3 的表达

使用200 μg/mL 的AGE 诱导髓核细胞退变。与Ctrl 组比较,AGE 组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),而且AGE 组NLRP3、ASC、Caspase1 的表达均上调(P<0.05)。与Ctrl 组比较,AGE 组髓核细胞中lncRNA HOTAIR 的表达上调(P<0.05),而miR-22下调(P<0.05)。双荧光素酶报告实验检测发现,lncRNA HOTAIR 可直接结合miR-22,且miR-22 可与NLRP3的3'UTR结合,见图1。

图1 lncRNA HOTAIR、miR-22、NLRP3炎症小体在AGE诱导的髓核细胞退变中的表达

2.2 过表达lncRNA HOTAIR 促进炎症小体的激活和细胞凋亡

与Vector 组比较,HOTAIR 组的lncRNA HOTAIR表达显著增加(P<0.05)。与Vector 组比较,HOTAIR组NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均上调(P<0.05),且髓核细胞的凋亡率显著升高(P<0.05),miR-22表达显著降低(P<0.05),见图2。

图2 lncRNA HOTAIR 过表达对NLRP3炎症小体和髓核细胞凋亡的影响

2.3 lncRNA HOTAIR 通过抑制miR-22 激活NLRP3促进的细胞凋亡

与Ctrl 组比较,HOTAIR 组细胞凋亡数明显增加(P<0.05);与HOTAIR 组比较,HOTAIR+mimic 组及HOTAIR+mcc950 组细胞凋亡数均显著减少(P<0.05),见图3。

图3 lncRNA HOTAIR 通过抑制miR-22激活NLRP3促进的细胞凋亡

2.4 lncRNA HOTAIR 通过抑制miR-22 激活NLRP3介导的炎症小体

与Ctrl 组比较,HOTAIR 组lncRNA HOTAIR 以及NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均上调(P<0.05),而miR-22 的表达显著下调(P<0.05)。与HOTAIR 组比较,HOTAIR+mimic 组lncRNA HOTAIR 的表达无显著变化(P>0.05),miR-22 的表达显著上调(P<0.05),而NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均显著下调(P<0.05)。与HOTAIR 组比较,HOTAIR+mcc950 组lncRNA HOTAIR 和miR-22 表达均无显著变化(P>0.05),而NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白表达均显著下调(P<0.05),见图4。

图4 髓核细胞中lncRNA HOTAIR、miR-22以及NLRP3炎症小体标志物的表达

3 讨论

IDD 是一种常见的退行性疾病,lncRNA 在其发病机制中起到重要作用[10-13]。2014年,Wan等[14]首次报道了人类IDD 中lncRNA 的表达谱,与健康人群相比,IDD 人群中lncRNA HOTAIR(NR_003716)的表达差异显著。本研究发现,在AGE 诱导髓核细胞退变过程中,lncRNA HOTAIR 表达显著上调,并且进一步证明其具有促进HNPC 细胞凋亡的能力。此外,本研究发现,lncRNA HOTAIR 通过与miR-22 和靶基因NLRP3的直接靶向结合,调控NLRP3 炎症小体的激活。这些发现为以lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴作为IDD的治疗靶点提供了新线索。

先前的研究表明,ceRNA 调控网络在IDD 中具有重要作用[15-19]。lncRNA HOTAIR 可通过与miR-34a、miR-22等miRNAs相互作用来调控髓核细胞凋亡[20-21],且miR-22 是一种被充分证明受ceRNA 网络调控并参与介导多种细胞过程的miRNA[22],其可促进HNPC 细胞增殖,抑制HNPC 细胞的退行性改变并减缓细胞衰老[23]。本研究证实了miR-22 在AGE 诱导后的HNPC细胞中显著降低,而且过表达lncRNA HOTAIR 显著抑制了miR-22 的表达,表明lncRNA HOTAIR 可以负向调控miR-22。有趣的是,我们进一步研究发现,lncRNA HOTAIR 与miR-22 直接靶向结合。此外,lncRNA HOTAIR 过表达可以促进HNPC 细胞凋亡并抑制miR-22 的表达,过表达miR-22 后明显逆转了这种促进作用,表明HNPC 细胞凋亡受lncRNA HOTAIR/miR-22轴的调控。

另外,本研究进一步发现,miR-22 与NLRP3 直接靶向结合。AGE 诱导后NLRP3炎症小体明显被激活,且当lncRNA HOTAIR 过表达后可以显著上调NLRP3、ASC、Caspase1 蛋白,从而促进NLRP3 炎症小体激活。当mcc950 抑制NLRP3 后,明显逆转了lncRNA HOTAIR 对凋亡和炎症小体的促进作用。过表达miR-22 后明显逆转了这种促进作用,表明HNPC 的细胞凋亡和炎症小体都受lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3轴的调控。

尽管在体外实验中观察到了lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴在促进HNPC 细胞凋亡和炎症小体激活中的重要作用,但仍需要进一步研究来验证这种调控机制在体内是否能逆转IDD 的发生和发展。例如,开展动物模型实验和临床研究来评估针对lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴的治疗策略是否能够有效改善IDD患者的病情。

综上所述,lncRNA HOTAIR 通过调控miR-22 和NLRP3 的表达,参与了椎间盘髓核细胞凋亡和炎症小体的激活。本研究表明,以lncRNA HOTAIR/miR-22/NLRP3 轴作为IDD 的治疗靶点非常有前景,可用于IDD治疗的候选药物的研究中。

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