骨肉瘤免疫治疗进展△

杜建航，鲍小刚，许国华，李得见*

（1.复旦大学附属浦东医院骨科，上海 200120；2.海军军医大学第二附属医院骨科，上海 200003）

骨肉瘤是起源于骨骼的最常见的恶性肿瘤，通常影响青少年和年轻人［1］。尽管原发性肿瘤可以通过手术切除，但如果不进行辅助化疗，最终仍有很高的风险发生肺转移［2］。即使手术后进行辅助化疗，预计只有2/3 的局部骨肉瘤患者可以治愈，而转移性或复发性骨肉瘤患者的长期生存率低于30%［3］。由于无法有效优化现有的治疗方法以及确定新的活性药物，使得在过去的30 多年中一直无法改善治疗效果。考虑到这些限制，仍需要进一步探索新的治疗方法。近年来，免疫疗法在各种成人癌症中显示出较好的应用前景，包括非细胞疫苗、树突状细胞（dendritic cells,DC）疫苗、过继细胞疗法、免疫检查点抑制剂和联合疗法等，但其在骨肉瘤中的应用尚未得到开发。

1 骨肉瘤免疫治疗的发展

一些证据表明，骨肉瘤可能对基于免疫的治疗方法敏感。骨肉瘤的CD8 阳性浸润淋巴细胞百分比高于其他亚型的肉瘤［4］，并且浸润程度与生存率呈正相关［5］。骨肉瘤基因组的不稳定程度很高，一些肿瘤表达了程序性细胞死亡蛋白1 配体（programmed cell death protein-1 ligand,PD-L1）［6］，表明骨肉瘤对PD-1（programmed cell death protein-1）/ PD-L1 轴抑制剂的潜在敏感性［7，8］。此外，还有许多细胞表面蛋白可能与抗体靶向结合。最近关于米伐木肽的一些实验结果引人注目。它是细菌细胞壁的类似物，可以触发单核细胞和巨噬细胞的活化并改善肿瘤控制。目前米伐木肽已在欧洲获准用于治疗骨肉瘤，部分是基于一项III 期随机研究显示接受米伐木肽联合常规化疗的骨肉瘤患者的总生存期得到改善［9］。

2 非细胞疫苗

基于肽或病毒的疫苗可以在体内将抗原直接呈递至树突状细胞（dendritic cells,DC）。尽管对肽疫苗的评估受到限制，但是针对融合蛋白断点区域的早期试验表明，只有1/16 的患者具有免疫反应并且1 例患者出现了混合临床反应［10］。病毒疫苗在早期试验中显示出了前景，其中1 例患者在应用DC 靶向的慢病毒LV305 治疗后，转移复发性滑膜肉瘤表现出明显的消退［11］。该疫苗还正在与NY-ESO-1 和TLR-4（toll-like receptor Toll）激动剂进行联合评估。其他HER2 靶向的疫苗策略已在临床前模型中显示出了优势，包括对骨肉瘤的犬科研究。与历史对照组相比，靶向HER2 的利斯特氏菌可降低转移风险并提高生存率［12］。

另一种非基于细胞的方法涉及直接在肿瘤内注射减毒的溶瘤病毒，后者在缺乏固有免疫的肿瘤细胞中优先扩增。一旦溶瘤病毒被注射到肿瘤细胞中，它就以与传统疫苗类似的方式介导炎症和继发的免疫反应，这可能导致肿瘤溶解，并通过表位扩散扩大免疫反应。在最近完成的I 期临床试验中，溶瘤HSV1716被用于治疗复发性肉瘤，这可能为新的溶瘤病毒设计和组合方法创造了条件。

3 DC 疫苗

近来已开发出各种用于晚期肉瘤的细胞免疫疗法［13］。用肿瘤裂解物负载的DC 进行治疗，显著增加对细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）活性的诱导，并提高了血清γ 干扰素（interferon-γ,IFN-γ）的水平。DC 被用于增强肿瘤特异性免疫反应，因为DC 是主要的抗原呈递细胞，可在体内引发细胞免疫反应［14］。肿瘤裂解物负载的DC 和冷冻治疗的肿瘤再植入可引发血清IFN-γ 水平升高，肺转移减少和CD8 阳性T 淋巴细胞数量增加［14］。Kawano［15］报道了在骨肉瘤小鼠模型中用肿瘤裂解物负载的DC 和抗细胞毒性T 淋巴细胞抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）抗体联合治疗的效果。在这项研究中，用抗CTLA-4 抗体或经肿瘤溶解物负载的DC 进行治疗，可引起CD8 阳性T 淋巴细胞数量增加，抑制原发和转移性病变的生长，延长生存期，减少调节性T 淋巴细胞的数量，并增加血清IFN-γ 的水平，这些治疗方法的结合可增强全身免疫应答。此外，用肿瘤溶解物负载的DC 和抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor,GITR）抗体联合治疗可增强全身免疫反应［16］。一项基于DC 免疫治疗的1/2 期临床试验中纳入了37 例骨和软组织肉瘤患者［17］，使用肿瘤裂解物，TNF-α（tumor necrosis factor-α）和OK-432 刺激的DC 进行治疗，引起IFN-γ 和IL-12 水平升高，而没有严重毒性。在接受临床反应评估的35 例患者中，有1 例（3%）表现出部分反应，6 例（17%）表现出疾病稳定，28 例（80%）表现出疾病进展［17］。

另一方面，一项在13 例骨肉瘤复发患者中，使用肿瘤溶解物和匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemocyanin,KLH）负载的自体DC 疫苗进行的I 期试验，显示没有明显的毒性，然而12 例患者中，只有2 例表现出对肿瘤的特异性T 细胞免疫反应的诱导。在一项使用肿瘤裂解物和KLH 进行免疫疗法I 期研究中，尽管患者没有临床反应，但是12 例骨肉瘤复发患者中有2 例诱导出了针对肿瘤的特异性T 细胞免疫反应［18］。在使用肿瘤裂解物负载的DC 进行免疫治疗的I 期研究中，每10 例患有实体瘤的小儿患者中，有5 例表现出疾病控制，而1 例表现出肿瘤消退［19］。Merchant 等［20］报道了62%的转移性和/或复发性小儿肉瘤患者接受了自体淋巴细胞，肿瘤溶解产物/ KLH 负载的DC 疫苗或重组人IL7 免疫治疗后，表现出T 细胞反应，反应者的生存期延长。在基于DC 免疫疗法的临床研究中，没有严重不良反应的报道。这些研究表明，在复发性骨肉瘤中DC 疫苗策略是安全的，并且可以使患者产生免疫反应，然而仅在某些患者中可改善临床疗效。为了改善骨肉瘤的细胞免疫疗法，需要进一步研究肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen,TAA）联合疗法和相关的适应证。

4 过继细胞疗法

癌症疫苗试图通过抗原呈递和新T 细胞反应的引发/扩展来诱导肿瘤免疫反应。相比之下，过继性细胞疗法（adoptive cellular therapy,ACT）规避了免疫检查点阻滞（immune checkpoint blockade,ICB）靶向的T 细胞活化步骤和疫苗方法。ACT 利用CD8 阳性CTL 直接给药。由Steven Rosenberg 等在美国国家癌症研究所率先采用的早期方法包括将自身肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte,TILs） 分离，离体扩增和向转移性黑色素瘤患者中输注。这项早期工作证明了针对肿瘤抗原离体制造的细胞疗法具有显著的临床反应，并强调了预处理条件对增强移植细胞群植入和持久性的重要性［21］。

此后开发出了两种类型ACT 作为TIL 疗法的可行替代品：转基因T 细胞受体（transgenic T-cell antigen receptor,tgTCR）和嵌合抗原受体（chimeric antigen receptors,CAR）。两种方法都利用工程改造的细胞表达具有已知肿瘤抗原识别能力的受体。在内源性免疫应答过程中，自身抗原呈递MHC-I，以诱导CD8 阳性CTL 应答，而MHC-II（major histocompatibility complex）类抗原呈递则驱动CD4 阳性辅助T 细胞应答。内源性抗原在MHC-I 上的呈递，包括由细胞内蛋白质突变编码的肿瘤特异性抗原，使得CTL能够以MHC 限制性方式识别几乎任何内源性或外源性肽。相反，CAR 是使用来自抗体的细胞外结合域与T 细胞受体的细胞内信号传导域进行融合而工程改造的。由于在血液系统恶性肿瘤中以CD19 为靶点的治疗方法最好地印证了抗体的性质，即不需要在MHC 上呈递，因此能够对表面抗原进行高亲和力识别［22］。基于CAR 的方法已经专门针对小儿肉瘤进行了试验，包括HER2/ GD2 CAR-T 或NK（natural killer）细胞。

骨肉瘤低水平表达HER2，使其对基于抗体的治疗方法具有抵抗力，但易于被HER2 CAR 杀伤，如先前在体外和患者来源的异种移植模型中所示［23］。2015 年一项I/II 期试验以评估HER2 CAR 在19 例诊断为HER2 阳性肉瘤患者中的安全性和有效性：其中16 例骨肉瘤，1 例尤因肉瘤，1 个原始神经外胚层肿瘤和1 个增生性小圆形细胞瘤［24］。研究中没有发现剂量限制的毒性。尽管有报告称转移性结肠癌患者使用HER2-CAR 后会产生严重的不良反应［25］，但有学者提出使用较低的CAR 剂量，利用不同的抗原识别和信号传导域，去除IL-2，及无预处理可改善耐受性［24］。值得注意的是，CAR 治疗后3 例患者在1年后仍可缓解，其中1 例表现出明显的肿瘤内坏死，坏死率大于90%。有待确定HER2 CARs 体内扩增的增强是否会导致反应的改善［24］。

据报道神经节苷脂GD2 和GD3 在骨肉瘤细胞上高表达，包括复发时［26］，使其成为有吸引力的靶标。在其他类型的小儿肉瘤中，似乎GD3 的表达仍高于GD2。靶向GD2 的CARs 在H3-K27M+突变型神经胶质瘤中表现出显著的临床前活性，并且在用诱导型CAR 分子治疗的尤因肉瘤模型中显示出一些抗肿瘤活性［27］。其他临床前数据表明，用GD2 特异性CAR 转导活化的NK 细胞，可以增强NK 细胞体外裂解EWS 细胞的能力［28］。这些研究的大量数据证实了ACT 对小儿肉瘤患者的活性。更好地了解可能产生治疗反应的人群有助于使ACT 反应最大化。

5 免疫检查点抑制剂

如果没有离体扩增，内源性TILs 通常无法抑制肿瘤，因为恶性肿瘤细胞通过检查点配体抑制免疫反应逃避了免疫监视［29］。检查点抑制剂通过MHC 重新激活T 细胞介导的针对肿瘤抗原的抗肿瘤反应，从而逆转了这一过程［30］，其中MHC 对新抗原的反应最大，不同于宿主组织上的新抗原。尚未研究证明骨肉瘤中复杂的基因组和染色体不稳定性会导致高突变负担；然而高水平的遗传不稳定可能会产生新表位，这些新表位是免疫介导杀伤的底物，因此对肿瘤可以使用检查点抑制剂，包括针对CTLA-4，PD-1 和PD-L1［31］。

CTLA-4 是在调节性T 细胞和记忆T 细胞上表达的跨膜糖蛋白受体，与DC 上的CD80/86 结合后会导致免疫功能抑制［32］。与健康受试者相比，骨肉瘤患者的CLTA-4 表达增加［33］。PD-1 是在T 细胞上表达的另一种跨膜免疫球蛋白家族成员，在慢性激活的T细胞中表达最高［34］。PD-1 通过抑制CTL 并激活调节性T-细胞充当了免疫系统的“制动器”，并且其配体PD-L1 在一部分的骨肉瘤细胞以及骨肉瘤样本中的免疫细胞中表达［35］。检查点抑制剂在几种不同成年癌症中取得的成功，引起了人们对于其在骨肉瘤治疗中的潜在应用的极大兴趣。

Merchant 等［36］报道了CTLA-4 抑制剂ipilimumab 在患有复发性实体瘤的儿童中进行的I 期研究，其中包括8 例患有骨肉瘤的儿童。他们显示出与成人相似的毒性和药代动力学，激活和循环中的CTL 数量增加，而调节性T-细胞数量没有增加。然而，没有观察到客观的抗肿瘤反应。肉瘤研究合作联盟最近测试了pembrolizumab 用于治疗肉瘤，并报告了22例复发性骨肉瘤患者中的一部分反应（4%）。现在许多研究正在测试抑制CTLA-4，PD-1 和PD-L1 的各种组合。

6 联合疗法

可以通过利用免疫疗法的特定机制来设计合理的联合疗法。例如，CTLA-4 和PD-1 影响免疫应答的不同成分。CTLA-4 在CD4 效应子区的激活中起主要作用，特别是诱导ICOS+Th1 样CD4 效应子的扩增，而PD-1 主要调节CTL 的增殖［37］。PD-1 和CTLA-4 阻断剂联合用于转移性黑色素瘤的研究已显示出临床获益，其中30%的患者表现出＞80%的肿瘤缩小率，因此FDA（Food and Drug Administration）批准nivolumab 和ipilimumab 用于无BRAF 突变的转移性黑色素瘤［38］。临床前的小鼠骨肉瘤转移模型已显示，单独用PD-1 阻断治疗可下调PD-L1 并上调CD80 和CD86［39］。在小鼠转移性骨肉瘤模型中同时阻断CTLA-4 和PD-L1，可实现对50%小鼠肿瘤扩散的完全控制，从而产生肿瘤免疫力［39］。目前儿童肿瘤小组正在对该疾病的复发或难治性实体瘤进行I/II 期研究。

鉴于TILs 与抗PD-L1 治疗的有效性相关，检查点抑制剂可能会增加TILs 的活性［40］。这对于骨肉瘤可能尤其有用，因为相比原发肿瘤，TIL 的密度和PD-L1 在转移病灶中的表达较高。考虑到肺转移是导致骨肉瘤患者死亡的主要原因，TIL 和检查点抑制剂的联合治疗是很有吸引力的［41，42］。检查点抑制剂也可能增加CAR-T 细胞和BiTE 抗体的活性，这可能受到调节性T 细胞升高，免疫抑制性细胞因子，基因组不稳定，靶抗原表达缺失，引起T 细胞衰竭的抗体形成以及PD-1 上调的限制［43］。最后基于令人鼓舞的临床前数据，检查点抑制剂在I 期试验中也与基因修饰的T 细胞疗法和癌症疫苗相结合。

7 总结与展望

在过去的三十多年中，由于未能找到新的有效药以及无法优化现有药物的使用方法，因此在改善骨肉瘤患者预后方面的进展受到了限制。骨肉瘤的一些生物学特征表明调节免疫应答可能会带来益处，并且现在的各种治疗方法使得免疫治疗很受欢迎。然而，免疫系统的复杂性和肿瘤特异性微环境的细微差别凸显了这项任务的艰巨性。如常规化疗所见，肿瘤利用多种途径抵抗免疫疗法，这表明需要联合治疗来实现有意义且持久的反应。目前仍然需要大量的研究进一步阐明现有免疫疗法的抗药性机制，开发和检测解决耐药性的合理联合疗法，以及探索预测性生物标志物以指导这些疗法的合理使用。希望免疫疗法可以带来突破，彻底改变骨肉瘤的治疗方法。