蠲痹汤基准样品“一测多药”薄层鉴别方法研究△

高永坚，汤春花，林碧珊，陈锦霞，梁凤友，曾杉

国药集团广东环球制药有限公司，广东 佛山 528305

蠲痹汤出自清代程国彭[1]《医学心悟》，原文记载“通治风、寒、湿三气，合而成痹。羌活（行上力大）、独活（行下力专，各一钱）、桂心（五分）、秦艽（一钱）、当归（三钱）、川芎（治风先治血，七分）、甘草（炙，五分）、海风藤（二钱）、桑枝（三钱）、乳香（透明者）、木香（止痛须理气，各八分）水煎服”。该方主治卒中身体烦痛、项背拘急、手足冷痹等[2]，临床广泛用于治疗类风湿性关节炎、痛风性骨关节炎、膝骨关节炎等骨伤科疾病[3-8]。

薄层鉴别是控制中药质量的重要分析手段。检索《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（一部）[9]可知，成方制剂中收载的薄层鉴别方法多为每种药味对应1个薄层鉴别方法，1个中药复方制剂的薄层鉴别需要开发多个方法才能完成，费时、费力、费试剂，检测效率低。2020 年10月，国家药品监督管理局药品审评中心发布的《中药新药质量标准研究技术指导原则（试行）》[10]鼓励建立同时鉴别多个药味的薄层色谱方法。为高效把控蠲痹汤基准样品的质量，本研究以“一测多药”为目标建立薄层鉴别方法，采用1 个薄层色谱系统同时鉴别蠲痹汤基准样品中当归、川芎、羌活和独活4 个药味，降低检测成本，提高检测效率。本研究建立的方法可与指纹图谱、特征图谱及含量测定方法形成互补，为蠲痹汤中药复方制剂的开发提供参考。

1 材料

1.1 仪器与耗材

ATS4 型全自动点样仪、Visualizer 2 型成像系统（瑞士卡玛公司）；BT25S 型分析天平（德国赛多利斯公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；RE-5220 型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）；DZTW 型调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）。硅胶GF254薄层板（批号：20210107，青岛海洋化工厂分厂）；TLC Silica gel 60 F254薄层板（批号：HX062464，德国Merck 公司）；硅胶HSGF254薄层板（批号20151204，烟台市化学工业研究所）。

1.2 试药

对照品羌活醇（批号：111820-201705，纯度：99.9%）、藁本内酯（批号：111737-201608，纯度：99.9%）、独活对照药材（批号：120940-201612）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，批号：213476，Fisher Chemical 公司）；乙酸乙酯（批号：20211012）、无水乙醇（批号：20220113）、石油醚（60～90 ℃，批号：20210202）、正己烷（批号：20210524）、环己烷（批号：20210825）、二氯甲烷（批号：20210714）均为分析纯，购于北京市通广精细化工公司；硫酸[分析纯，批号：20201105，现代东方（北京）科技发展有限公司]；甲酸（分析纯，批号：A2106152，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.3 样品

羌活、独活、肉桂、秦艽、当归、川芎、甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香药材均购自主产区或道地产区。经广东一方制药有限公司潘礼业主任工程师鉴定，羌活为伞形科植物羌活Notopterygium incisumTing ex H.T.Chang 的干燥根茎和根、独活为伞形科植物重齿毛当归Anglica pubescensMaxim.f.biserrata Shan et Yuan 的干燥根、肉桂为樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl 的干燥树皮、秦艽为龙胆科植物秦艽Gentiana macrophyllaPall.的干燥根、当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels 的干燥根、川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎、甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎、海风藤为胡椒科植物风藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi 的干燥藤茎、桑枝为桑科植物桑Morus albaL.的干燥嫩枝、乳香为橄榄科植物乳香树Boswellia carteriiBirdw.树皮渗出的树脂、木香为菊科植物木香Aucklandia lappaDecne.的干燥根。上述11 味药材按《中国药典》2020 年版[9]检验均合格。乳香饮片参照《安徽省中药饮片炮制规范》2019 年版[11]炮制，其他饮片按《中国药典》2020 年版[9]炮制。本方11 味药材的产地信息见表1。

表1 蠲痹汤11味药材的产地信息

2 方法

2.1 蠲痹汤基准样品制备方法

取羌活3.73 g、独活3.73 g、肉桂1.87 g、秦艽3.73 g、当归11.19 g、川芎2.61 g、蜜炙甘草1.87 g、海风藤7.46 g、桑枝11.19 g、乳香2.98 g、木香2.98 g 混合，加水400 mL，浸泡30 min，武火煮沸后，文火微沸煎煮30 min，350 目筛网趁热滤过，滤液冷冻干燥得蠲痹汤基准样品。15 批蠲痹汤基准样品组方药材信息见表2。

表2 15 批蠲痹汤基准样品组方药材信息

2.2 供试品溶液的制备

取基准样品2 g，加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL 溶解，加石油醚（60～90 ℃）振摇提取2 次，每次20 mL，合并石油醚液，蒸干，残渣加乙酸乙酯2 mL溶解，即得。

2.3 对照药材溶液制备

取独活对照药材0.2 g，加甲醇5 mL，超声15 min，滤过，取滤液，即得。

2.4 对照品溶液制备

取藁本内酯对照品、羌活醇对照品，加甲醇制成质量浓度分别为1.0、0.3 mg·mL-1的溶液，即得。

2.5 阴性对照溶液制备

分别取缺少当归、川芎和缺少独活的基准样品各2 g，按照2.2 项下的方法制备阴性对照溶液。

2.6 显色剂的配制

取硫酸5.7 mL，缓缓注入适量无水乙醇中，冷却至室温，再用无水乙醇稀释至100 mL，摇匀，即得。

2.7 “一测多药”鉴别方法

参照薄层色谱法（《中国药典》2020 年版[9]通则0502）试验，吸取供试品溶液3～5 μL、对照药材溶液和对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5.0∶1.0∶2.0∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与藁本内酯对照品色谱相应的位置上显相同深蓝色斑点；再喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与羌活醇对照品和独活对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。

2.8 方法学考察

2.8.1 专属性考察 吸取对照品溶液与对照药材溶液各2 μL，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各3 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，按2.7 项下方法鉴别。结果表明，供试品在与对照品和对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照色谱中均未出现干扰斑点，说明该方法可以对当归、川芎、羌活和独活专属鉴别。

2.8.2 耐用性考察

2.8.2.1 薄层板的考察 吸取对照品溶液与对照药材溶液各2 μL，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各3 μL，分别点于3 个品牌的GF254薄层板上，按2.7 项下的方法鉴别，结果显示，3 个品牌的薄层板对鉴别影响不大，后续研究选用德国Merck公司TLC Silica gel 60 F254薄层板。

2.8.2.2 温度的考察 吸取对照品溶液与对照药材溶液各2 μL，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各3 μL，按2.7 项下方法，分别在不同的温度环境（低温4 ℃、常温24 ℃、高温40 ℃）进行鉴别，结果表明，不同温度下供试品斑点检视效果差异不大。

2.8.2.3 相对湿度的考察 吸取对照品溶液与对照药材溶液各2 μL，阴性溶液、供试品（批号：JB211108-1）溶液各3 μL，按2.7 项下方法，分别在不同相对湿度（25%、50%、75%）环境下进行鉴别，结果表明，不同相对湿度对检视效果基本无影响。

3 15批基准样品的鉴别

按照2.7 项下的方法，对15 批蠲痹汤基准样品中当归、川芎、羌活、独活进行鉴别，结果见图1。15 批供试品在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，均显示相同颜色的斑点。表明该方法耐用性较好，可以进行专属鉴别。

图1 15批蠲痹汤基准样品的薄层色谱图

4 讨论

《医学心悟》中记载蠲痹汤剂量为“羌活、独活各一钱，桂心五分，秦艽一钱，当归三钱，川芎七分，甘草五分，海风藤二钱，桑枝三钱，乳香、木香各八分”[1]，根据《经典名方开发指引》[12]可知，本方剂量按照一钱约等于3.73 g 折算，照此折算后各药剂量在《中国药典》2020 年版[9]的指导剂量范围内。关于煎服方法，原方仅载“水煎服”，其余医籍中均未记载该方的制法和服法，或同《医学心悟》一致，仅言“水煎服”，故本方采用原方记载“水煎服”。按照《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》[13]的相关要求，本方参照《医疗机构中药煎药室管理规范》[14]进行煎煮。

关于鉴别方法的选择，《〈中国药典〉中药质量标准研究制定技术要求》[15]强调薄层色谱可将中药内含成分通过分离达到直观、可视化，具有承载信息大、专属性强、快速、经济、操作简便等优点，可作为中药鉴别的首选方法。基于此，本研究用1 个薄层系统同时鉴别蠲痹汤物质基准中的当归、川芎、羌活和独活4 种药味，专属性强、耐用性好，提高了检测效率。

在薄层鉴别方法开发的过程中，分别考察了供试品溶液制备方法、展开剂、点样量、点样方式及加热时间等因素的影响，结果表明，按2.2 项下方法制备的供试品溶液无乳化现象，符合实验要求；展开剂为环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（5.0∶1.0∶2.0∶0.2）时，斑点更清晰，比移值（Rf）适中，且阴性无干扰；供试品溶液点样量为3～5 μL时，斑点颜色更清晰、适中；点样方式（点状和条带状点样）对本薄层鉴别影响不大，本研究选择8 mm 条带宽度点样；当加热时间超过2 min 时，供试品的斑点清晰，阴性无干扰。

在薄层鉴别中，Rf 是系统适用性试验的考察指标，色谱斑点的Rf 最重要的影响因素是吸附剂的性质，以及展开剂的极性和溶解能力，当应用同一种吸附剂和同一种展开系统时，被测物质的Rf 还受展开容器中展开剂蒸汽的饱和度、薄层板含水量、边缘效应等因素的影响，从而导致同一特征斑点Rf 有一定的大小变化[16]。本研究主要特征斑点的Rf 基本在0.2～0.8。蠲痹汤基准样品经过水煎煮，其中独活的特征成分蛇床子素质量分数很低（0.05%左右），前期建立的指纹图谱无法获取其特征峰，而通过本研究建立的薄层鉴别法可实现对独活药味的有效鉴别，是指纹图谱的有效补充，且能与含量测定相互印证，检测效率高，具有很好的应用价值。