不同生长年限与采收季节对何首乌中14个成分含量的影响△

李妍怡，汪祺，杨建波，王莹，刘越，文海若，张玉杰*，马双成*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102400；

2.中国食品药品检定研究院，北京 100050

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根，为常见的补益类中药，在临床中广泛应用，作为药物首次记载于《何首乌传》中，后在历代本草中均有记载[1]。其性微温，味苦、甘、涩，生品解毒消痈、截疟通便；制品味滋腻，可补肝肾、化浊、调脂[2-3]。随着药材质量研究的深入，何首乌的规范采收季节和年限引起了人们的广泛关注。明代《本草品汇精要》记载：“春末、夏中、初秋，候晴明日取根”[4]。清代《药物出产辨》记载：“自立冬至立春为最适宜，成分亦好”[5]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版规定：“于秋、冬二季叶枯萎时采挖”[2]。由古法四季采收，演变为秋冬采收是否有据可依未见详细研究报道；此外，何首乌的采收年限也未见明确规定。中医界历来视广东德庆为何首乌道地产区，其所产何首乌条壮、色正、粉性足、药效高。因此本研究选用广东德庆何首乌药材，对各生长年限和采收季节何首乌中质量指标的变化规律进行了探索研究。

二苯乙烯苷类化合物为蓼科植物中何首乌特有的一类活性成分，在植物体内含量较高；黄酮、酚酸类化合物在植物体内广泛存在，其化学性质较为活泼，推测其随季节年限变化明显。故本研究采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱法（UPLC-QQQMS/MS）对何首乌中二苯乙烯苷类、黄酮类和酚类成分进行含量分析，监测上述3 类成分随生长年限、采收季节发生的变化，为古今采收时间异同提供实验数据的支撑，并对何首乌质量评定指标的确立提供理论参考。

1 材料

1.1 仪器

LCMS-8050 型UPLC-QQQ-MS/MS 系统（日本岛津公司）；KQ-300DA 型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；C800 型凌生多功能粉碎机（永康市红太阳机电有限公司）；MSA6.6S-CE型百万分之一分析天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

对照品反式-2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（trans-THSG，批号：110844-201915）、虎杖苷（批号：111575-201603）、白藜芦醇（批号：111535-201703）、儿茶素（批号：110877-202005）、表儿茶素（批号：110878-201703）、金丝桃苷（批号：111521-201809）、芦丁（批号：100080-201811）、没食子酸（批号：110831-201906）均购自中国食品药品检定研究院；对照品2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷（批号：C25S11Y125979）、对羟基苯甲酸（批号：D13O8S45560）、对羟基苯甲醛（批号：Y02J7C15574）、对香豆酸（批号：Y16O8C45561）均购自上海源叶生物科技有限公司；顺式-THSG（cis-THSG，批号：18012507，成都普菲德生物技术有限公司）；决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号：STC23540105，上海诗丹德生物技术有限公司）；所有对照品质量分数均≥98%；乙腈（德国Merck 公司）；甲醇（美国Fisher公司）；甲酸（美国Sigma公司）；超纯水（美国Millipore公司）；其余试剂均为分析纯。

1.3 药材

何首乌药材于2021 年春、夏、秋3 季收集自广东省肇庆市德庆县，经中国食品药品检定研究院张南平主任药师鉴定均为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根。样品来源信息见表1。

表1 何首乌样品来源信息

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱检测条件

色谱条件：ACQUITY UPLC™ HSS C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～3.5 min，90%～85%A；3.5～7.0 min，85%A；7.0～10.0 min，85%～74%A；10.0～12.0 min，74%～68%A；12.0～15.0 min，68%～64%A；15.0～17.0 min，64%A；17.0～31.5 min，64%～20%A；31.5～36.0 min，20%A；36.0～36.2 min，20%～90%A；36.2～41.0 min，90%A）；流速为0.4 mL·min-1；柱温为27 ℃；进样量为1 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正、负离子多反应检测（MRM）模式。空气作为干燥辅助气，体积流量为10 L·min-1，加热模块温度为400 ℃；氮气（N2）作为锥孔气，体积流量为3 L·min-1，脱溶剂管温度为300 ℃；氩气（Ar）用于碰撞诱导解离（CID）气体。检测模式为正、负离子同时扫描，离子源温度300 ℃，接口电压为3000 V；每个离子对驻留时间为23.8 ms。14 个成分的质谱参数见表2。

表2 何首乌中待测化合物质谱检测参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取1.3 项下药材粉碎后过四号筛（65 目），得不同采收时间样品细粉。精密称取何首乌样品1 g，加入50 倍量70%乙醇，置100 mL具塞锥形瓶中超声提取30 min，静置冷却后补足减失的质量，并用定量滤纸得续滤液25 mL。将续滤液置100 mL 蒸发皿中，95 ℃水浴加热挥干，用新配制备的70%乙醇溶解并定容至5 mL，澄清透明溶液经0.22 μm滤膜滤过后，即得供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取二苯乙烯苷类、黄酮类等对照品粉末适量，置于10 mL 量瓶中加甲醇溶解定容，得到各对照品母液；混合14 个成分的对照品母液，并用70%乙醇梯度稀释，最终得对照品混合储备液。

2.3 何首乌中14个成分的UPLC-QQQ-MS/MS分析

取2.2 项下溶液适量，进样分析，得到UPLCQQQ-MS/MS总离子流图（图1）。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 取2.2.2 项下对照品溶液，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得到何首乌中14 个化学成分的线性回归曲线，见表3。

表3 何首乌中14个化学成分的线性方程

2.4.2 精密度试验 精密称取1 年生夏季采收样品（编号1X）粉末1 g，按2.1、2.2项下条件与方法同天内连续进样6 次，计算日内精密度的RSD。结果显示，样品中14 个化学成分的平均日内精密度RSD分别为0.39%、0.61%、1.39%、0.76%、0.77%、1.49%、1.97%、2.86%、1.99%、2.80%、1.98%、3.26%、1.48%、1.67%，均小于4.0%，精密度良好。

2.4.3 重复性试验 精密称取1 年生夏季采收样品（编号1X）粉末1 g（平行称取6 份），按2.1、2.2项下条件与方法制备分析，分别进样3 针，随行标准曲线考察重复性。得trans-THSG、cis-THSG、2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、虎杖苷、白藜芦醇、儿茶素、表儿茶素、金丝桃苷、芦丁、没食子酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、对香豆酸和决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷的平均质量分数分别为19 662.08、243.02、71.12、43.10、211.39、654.59、75.14、0.18、0.62、76.79、5.74、29.91、27.13、197.66 μg·g-1，重复性RSD 分别为0.65%、0.97%、1.66%、2.76%、1.97%、0.67%、2.06%、2.68%、2.66%、1.67%、1.77%、0.97%、1.39%、1.19%，符合试验要求。

2.4.4 稳定性试验 取1 年生夏季采收样品（编号1X）供试品溶液，在室温分别放置0、2、4、8、12、24 h 后进样，考察14 个成分在室温下的稳定性。trans-THSG、cis-THSG、2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、虎杖苷、白藜芦醇、儿茶素、表儿茶素、金丝桃苷、芦丁、没食子酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、对香豆酸和决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷峰面积的RSD 分别为1.97%、1.96%、0.97%、1.36%、1.09%、2.47%、1.39%、2.39%、1.11%、2.85%、0.99%、1.93%、1.74%、1.89%，表明24 h室温放置稳定良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的1 年生夏季采收样品（编号1X）粉末0.5 g，加入与待测成分等质量浓度的各对照品溶液，按2.1、2.2 项下条件与方法制备分析（平行检测6 份），记录峰面积得到相应平均加样回收率。样品中trans-THSG、cis-THSG、2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、虎杖苷、白藜芦醇、儿茶素、表儿茶素、金丝桃苷、芦丁、没食子酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、对香豆酸和决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷回收率分别为101.19%、99.78%、100.04%、101.89%、99.82%、99.77%、100.80%、93.77%、99.36%、103.19%、96.60%、99.01%、99.98%、99.97%，RSD 分别为0.79%、0.83%、1.96%、0.80%、0.89%、0.66%、1.01%、0.69%、0.95%、1.63%、0.76%、0.91%、2.07%、1.89%，表明该方法准确度良好。

2.5 不同采收期14个化学成分的含量测定

参照2.2项下制备方法，按2.1项下条件进样分析，得不同季节年限的何首乌样品中14 个化学成分的质量分数，结果见表4。

选取不同采收年份的样品，将14 种成分的质量分数进行生长年限的比较（图2），可发现，与1 年生何首乌相比，随生长年限的增长，trans-THSG、白藜芦醇、决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷分别在春夏秋3 季中呈现先降低后升高的趋势（3 年生为谷值）；cis-THSG、没食子酸分别在夏秋、春夏秋季呈现先升高后逐渐降低的趋势（3 年生和4 年生为峰值）；2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、儿茶素、芦丁、对香豆酸分别在春季、春秋、春夏季、夏季随年限增加含量降低。

图2 不同采收季节、生长年限何首乌样品14个成分质量分数变化趋势（,n=3）

将上述样品按采收季节进行均值处理，并与春季采收何首乌中相应成分的含量比较，见表4，结果可得trans-THSG夏秋两季含量逐渐降低；cis-THSG逐渐升高；2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、虎杖苷、儿茶素、芦丁、决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷含量春季高于夏秋两季；白藜芦醇、表儿茶素、没食子酸、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲醛、对香豆酸小分子物质夏季高于春秋含量；金丝桃苷仅夏季采收样品中含有微量。

何首乌二苯乙烯苷、黄酮、酚类成分在不同采收季节含量变化明显，此外trans-THSG、cis-THSG、2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、白藜芦醇、儿茶素、没食子酸、决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷总体含量较高，考虑其作为何首乌质量评价的潜在指标成分。

3 讨论

《千金翼方》中指出“夫药采取，不知时节，不以阴干暴干，虽有药名，终无药实，故不依时采收，与朽木不殊，虚费人工，卒无捭益”[6]，强调依时采收的重要性。故本研究采用UPLC-QQQ-MS/MS 研究不同采收季节和生长年限对何首乌中二苯乙烯苷、黄酮、酚类14 个化学成分含量的影响，为其药材的质量控制和安全性研究提供理论支持。

何首乌为多年生草本植物，生长年限的增加能介导物质转化积累，进而影响药材毒效作用。研究发现，何首乌中主要二苯乙烯苷类trans-THSG 和cis-THSG 随生长年限呈现相反的含量变化趋势，提示随生长年限的增加植物体内可能存在trans-THSG与cis-THSG 的相互转换；黄酮和酚类多随生长年限的增加含量降低，推测可能与何首乌多年生长后木质化程度增加有关[7]。

一般认为秋冬为根茎类中药的适宜采收期，可能与秋冬之际气温降低、植物生长停滞、体内有效物质逐步积累有关。研究发现，二苯乙烯苷类化合物含量峰值多出现在春季，其中trans-THSG 含量远高于其他化合物，且秋季含量最低，仅为春季含量的1/3。黄酮类化合物大量成分含量峰值亦出现在春季，谷值可能为夏季（如儿茶素）或秋季（如芦丁）；值得注意的是，金丝桃苷仅在夏季何首乌样品中检测到微量。本研究结果与已有的相关文献报道[8-10]中测得二苯乙烯苷、黄酮、酚类成分含量变化规律基本一致。

蒽醌为何首乌内广泛分布的成分，前期研究发现，秋季采收何首乌样品中游离大黄素和大黄素甲醚含量低于夏季采收样品，结合蒽醌大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷含量远低于春夏采收样品[11]，其中结合蒽醌可能为毒性物质基础，具有肝细胞毒性[12-13]。二苯乙烯苷类为何首乌中特有化学成分，trans-THSG 具有潜在药物性肝损伤风险[14-16]。决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷为何首乌中的萘类成分，Yang等[17]通过斑马鱼胚胎发育模型发现其具有较强毒性作用。另有研究表明cis-THSG具有良好的调血脂活性[18-20]，可能为药物的有效作用成分。结合本研究结果，3年生秋季采收何首乌中所含潜在毒性物质大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、trans-THSG、决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷含量均低于其余采收样品，有效成分cis-THSG含量最高，故推测3年为适宜采收年限、秋季为适宜采收季节，与《中国药典》2020年版规定相符。

本研究发现，何首乌中14 个化学成分的含量随采收季节和生长年限的变化明显，且trans-THSG、cis-THSG、2,3,5,4ʹ-四羟基二苯乙烯-2-O-(2ʺ-O-阿魏酰)-β-D-吡喃葡萄糖苷、白藜芦醇、儿茶素、没食子酸、决明酮-8-O-β-D-葡萄糖苷含量较高、趋势清晰，可作为潜在的指标性成分。冬季气候严寒，考虑生产实际故选用秋冬交界11 月末采收样品，秋冬两季何首乌含量异同还需进一步探究和考证。