马鹿茸多肽A的表面结构分析△

任聪，邸学，龚伟，谢明*，李峰*

1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；

2.辽宁中医药大学 附属医院，辽宁 沈阳 110032

鹿茸Cervi Cornu Pantotrichum 是鹿科动物梅花鹿Cervus nipponTemminck 或马鹿C.elaphusLinnaeus 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，是中国传统名贵中药之一，距今已有2000 多年的药用历史，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的作用，主治肾阳不足、腰膝冷痛、筋骨萎软等[1]。

本课题组前期研究发现，马鹿茸药材对大鼠肾虚型骨质疏松症有较好的防治作用[2]，而马鹿茸中多肽成分在马鹿茸中含量最多，且是马鹿茸的补肾健骨作用的最显著的成分，因此，本课题组采用酶解法结合多级膜分离技术分离并纯化得到马鹿茸多肽A，利用高效凝胶过滤色谱法和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）测得马鹿茸多肽A 相对分子质量为200～3000 Da，纯度约30.70%。其水解后得到18种氨基酸，约占总氨基酸的26.40%；其中，组氨酸的含量最高，天冬氨酸含量最低，且8 种必需氨基酸质量分数为53.04%。游离氨基酸含有18种氨基酸，约占总氨基酸的23.60%；其中苏氨酸的含量最高，脯氨酸含量最低；8种必需氨基酸占60.18%。结合氨基酸中必需氨基酸质量分数为50.84%[3]。

本课题组前期研究证实，马鹿茸多肽A 能促进成骨细胞和骨髓间充质干细胞的增殖和骨向分化；对去卵巢所致骨质疏松症大鼠具有防治肾虚型骨质疏松症的作用[3-5]。为了探讨马鹿茸多肽A 结构与药效之间的关系，本研究对多肽A 的表面结构进行分析，以探究小分子物质表面结构对其活性和药效的影响。

原子力显微镜（AFM）是在扫描隧道显微镜（STM）基础上发展而来，与其他电子显微镜相比，AFM 的纳米量级的高空间分辨率尤为突出，被广泛地用于不同聚合物链构象的分析研究中，可在大气或溶液中直接观测到生物样品形貌[6]，研究结构与功能的关系，以及生物分子的相互作用[7-8]。AFM 在中药材的研究中多用于多糖结构的研究，如测定西洋参[9]、甘草[10]、党参[11]、女贞子[12]、马兰[13]等药材中多糖结构，同时利用AFM 也可对来源于不同产地的中药材（麦冬、玉竹、郁金等）[14]进行微区力学性质的定量表征。AFM 的定量数据将有效提升中药饮片产地鉴别的可靠性与科学性。因此，本研究采用AFM 对马鹿茸多肽A 的表观结构进行测定，探讨其结构对药效的影响。

1 材料

1.1 仪器

Dimension ICON型AFM（Bruker公司）。

1.2 试药

马鹿茸多肽A（相对分子质量为200～3000 Da），采用多级膜分离技术分离纯化，由本课题组自制[3,15]。

2 方法

2.1 AFM技术参数设置

扫描范围：icon 扫描管90 μm×90 μm×10 μm，fastcan 扫描管35 μm×35 μm×3 μm。X、Y方向噪音水平为开环控制<0.100 nm、闭环控制<0.150 nm。Z方向噪音水平为开环控制<0.030 nm、闭环控制<0.035 nm。可持续稳定得到原子级分辨率。X、Y方向最大扫描速度>2 mm·s-1，Z方向最大扫描速度>12 mm·s-1。扫描模式采用接触模式、轻敲模式、相位成像。

2.2 供试品溶液的配制

取马鹿茸多肽A 0.025 mg，精密称定，溶解于蒸馏水，稀释使其质量浓度分别为0.50、0.25、0.10 µg·mL-1，备用。

2.3 AFM样品的制备

将云母片裁剪成正方形，约1 cm×1 cm，共10块，用双面胶固定于培养皿中。仔细剥去若干层云母片的纹理，露出新鲜剥离的云母表面，分别用滴管吸取0.50、0.25、0.10 µg·mL-1的马鹿茸多肽A溶液1 mL，轻轻浸润10 min，用一次性注射器吸走云母表面多余的液体，保证表面留有薄薄的一层液膜，迅速滴加马鹿茸多肽A 溶液各5 µL 至新鲜剥离的云母片上，观察样品在云母片表面均匀分散，并自然吸附；在室温环境下干燥过夜，待样品干燥后即可进行AFM测定。

2.4 表观形貌的观测

分别取不同质量浓度的马鹿茸多肽A（0.50、0.25、0.10 µg·mL-1），设置比例尺分别为20、10、5 μm下进行二维（2D）和三维（3D）图像观察。

2.5 粗糙度、表面高度的测定

分别取不同质量浓度的马鹿茸多肽A（0.50、0.25、0.10 µg·mL-1），设置比例尺为10 μm，对粗糙度、表面高度进行测定。

2.6 功率谱密度（PSD）的测定

取质量浓度为0.10 µg·mL-1的马鹿茸多肽A，对功率谱密度进行测定。

3 结果

3.1 马鹿茸多肽A的表面形貌

设置比例尺为20 μm，当质量浓度为0.50 µg·mL-1时，马鹿茸多肽A 的二维（2D）结构均为深浅不均的条状；三维（3D）结构可见其整体为曲面结构，表面上具有长短不一的支链所形成的椎体状突起，见图1A、图1B。当质量浓度为0.25 µg·mL-1时，马鹿茸多肽A 的2D 与3D 结构均呈现出平板状；其支链的椎体状突起则呈现出粗细不均、长短不等的特性，见图1C、图1D。当质量浓度为0.10 µg·mL-1时马鹿茸多肽A 的2D 结构可见其板状结构基部为不规则网格状结构；3D 结构显示，其网格边缘为粗细不均、长短不等支链所形成的椎体状突起，且有些呈栅状、有些呈支链连接成片状，见图1E、图1F。

图1 不同质量浓度的马鹿茸多肽A表面结构的2D和3D图像

3.2 粗糙度

设置比例尺为10 µm。马鹿茸多肽A 质量浓度为0.10 µg·mL-1时算术平均粗糙度（Ra）为0.885 nm，均方根粗糙度（Rq）为1.12 nm，Ra/Rq为0.79；质量浓度为0.25 µg·mL-1时，Ra为2.73 nm，Rq为3.89 nm，Ra/Rq为0.70；质量浓度为0.5 µg·mL-1时，Ra 为0.401 nm，Rq 为0.601 nm，Ra/Rq 为0.67。不同质量浓度马鹿茸多肽A 粗糙度深直方图见图2。

图2 不同质量浓度马鹿茸多肽A的粗糙度深直方图和示意图

3.3 样品表面高度分布

设置比例尺为10 µm，马鹿茸多肽A 质量浓度为0.10、0.25、0.50 µg·mL-1时的表面高度分别为6.139 7、39.458 8、14.510 5 nm。设置参数的6 个承载点Bearing Area 1～6 占比分别为10%、25%、50%、75%、90%、0。承载区域及占比样品表面深度见表1。

表1 不同质量浓度马鹿茸多肽A承载区域占比及样品表面深度

3.4 PSD

马鹿茸多肽A 在波长0.208、0.097 µm 时X轴、Y轴和Z轴的能量、PSD见表2。

表2 马鹿茸多肽A在不同波长下的能量和PSD

4 讨论和结论

在AFM 测定中，样品的质量浓度对测定结果有很大的影响。质量浓度过大会导致多肽样品颗粒重叠，而无法观察到物质的整体的表观结构。本研究通过保持马鹿茸多肽的表面平整，高度起伏为10～20 μm，且基底面平滑，并相对均匀、分散等条件，同时设置5、10、20 µm 3个比例尺进行实验样品质量浓度的筛选，从而确定以0.50、0.25、0.10 µg·mL-1作为样品测定质量浓度。

由马鹿茸多肽A 的AFM 结构分析可知，其表面结构不是平面结构，而是整体呈曲面板状结构；其基部为不规则的网格状，网格边缘为粗细不均、长短不等支链所形成的椎体状突起，呈栅状或片状。依据马鹿茸多肽A 的结构特征分析，其基部的不规则的网格状结构能够使其结构更加稳定；其曲面板状结构可有效增加与作用靶点的接触面积；其栅状或片状的椎体支链结构更有利于和作用靶点的相互接触或渗入，从而使其更易发挥药效作用。粗糙度测定结果表明，随着质量浓度的增大，其粗糙度逐渐变小，说明表面起伏程度变小，样品表面更光滑。表面高度随着质量浓度的增加呈现出先增高又降低的趋势。同时，PSD 测定结果显示，随着波长增大，马鹿茸多肽A 的PSD 逐渐变大，X、Y和Z轴的各向同性PSD也越大；多肽样品与AFM 探针接触的排斥力产生的能量越大，其各向同性PSD 越大，则二维各向同性PSD 越大，说明样品对于测定的响应越灵敏。

多肽的基本组成单元为氨基酸，马鹿茸多肽A的这种立体结构可能是由于氨基酸中的-OH和-COOH分子间相互作用（交叉、重列）或肽链间的氢键缔合所致。由于多肽中的-OH 和-COOH 更利于透过细胞的磷脂双分子层[16]，被机体内吸收、代谢，从而促进与机体的反应；加之马鹿茸多肽A 特有的3D 结构特点，揭示了其组成与结构可能是防治骨质疏松症的重要基础，课题组将在后续的研究中验证完善。

为了使非导体也能够采用STM 进行观察，AFM由扫描隧道显微优化而发展形成。其具有纳米量级的高空间分辨率，被广泛地用于不同聚合物链，包括DNA[17-19]、蛋白质[20]、小核菌多糖[21]等多种小分子链构象的分析研究中。AFM 在中药材研究中多用于研究多糖结构，主要是对中药材中多糖结构特点的研究；还发现提取方法也对多糖结构产生一定的影响，如金钗石斛多糖的结构在酶解反应液经氨水碱化后发生裂解，由复杂的网状结构变为简单的分枝碎片结构，但其他提取方法得到的石斛多糖，其形貌结构均无太大差异[22]；热水提取的麦冬多糖呈现出有分支的细丝状，而超声提取的麦冬多糖分子则较为分散，呈现螺旋结构[23]。此外，还有研究应用AFM 对不同产地的麦冬、玉竹、郁金等饮片的硬度及黏性进行定量表征，增加了中医药理论表象描述的定量数据，为中药材辨状论质理论研究提供了新的思路与方法[14]。

虽然，AFM 已在中药材研究中有较多应用，但是用于中药材中多肽类物质表面结构研究的尚少见。本研究应用AFM 对马鹿茸多肽A 表面结构进行分析，为其特有结构与药效作用间构效关系的建立提供参考。