基于DNA条形码的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及混伪品等32种的鉴别△

王孟虎，许亮，蒋磊，李峰，孙一帆，康廷国，孟祥松，张圣阳，钟明月，黄文康，石飘柔

1.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600；

2.亳州学院，安徽 亳州 236800；

3.亳州市食品药品检验中心，安徽 亳州 236800；

4.亳州职业技术学院，安徽 亳州 236800；

5.中国药科大学，江苏 南京 210000

蕲蛇（Agkistrodon）为蝰科尖吻蝮属动物五步蛇Agkistrodon acutus（Guenther）的干燥体，乌梢蛇（Zaocys）为游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades（Cantor）的干燥体，金钱白花蛇（Bungarus Parvus）为眼镜蛇科动物银环蛇Bungarus multicinctusBlyth的幼蛇干燥体，具有祛风、通络、止痉的功效，主治风湿顽痹、中风、麻木拘谨、半身不遂等，均收载于《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版[1]。由于野生蛇类资源匮乏，人工养殖规模还未满足需求，导致市售蛇类药材价格较高。市售药材为不完整个体，常常掺杂有混伪品。为了保证用药的安全性、维护蛇类药材市场的稳定性，建立快速、准确鉴别蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其易混伪品的方法具有重要意义。

DNA 条形码由Hebert等[2-3]在2002年提出，陈士林等[4]在此基础上进行了大量研究，确立了动物类药材DNA条形码细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ）基因鉴定体系。由于该方法不受个体、环境等因素影响，能够准确、快速地对物种进行鉴定，现已应用在各动物类样品的鉴定及鉴别领域。晁志等[5]基于DNA条形码COⅠ基因对金钱白花蛇及其8种混伪品进行鉴定，显示各物种均独立聚为一支，其中游蛇科与眼镜蛇科为姐妹群。廖倩等[6]基于DNA 条形码COⅠ基因对23种蛇类进行鉴定，显示各物种均独立聚为一支，游蛇科与眼镜蛇科为姐妹群，链蛇属与白环蛇属亲缘关系较近，并支持前人研究中对锦蛇属的重新划分（玉斑锦蛇被归类于丽蛇属，称为玉斑丽蛇；三索锦蛇被归类为颌腔蛇属，称为三索颌腔蛇；王锦蛇仍归属于锦蛇属）。黄勇等[7]基于DNA条形码COⅠ基因对19 种蛇类进行鉴定，结果显示灰鼠蛇有可能被错误鉴定为乌梢蛇，赤练蛇种内遗传距离差异较大。石林春等[8]基于DNA条形码COⅠ基因对黑眉锦蛇、锦蛇、乌梢蛇蛇蜕进行鉴定，结果显示该方法能够准确鉴定3 种蛇蜕。崔丽娜等[9]基于DNA 条形码COⅠ基因对金钱白花蛇及4 种伪品进行准确鉴定。《中国药典》2020 年版利用性状、特异性引物对蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品进行鉴别，其中设计的特异性引物能够对正品进行扩增并有单一条带，而伪品则无条带[1]。虽然，利用该方法能够准确鉴定蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇，但却无法对混伪品进行鉴定，无法获知混伪品的基原信息。

在前人研究的基础上，本课题组收集蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品，结合从GenBank 下载的正品及混伪品COⅠ序列构建邻接（NJ）系统发育树，不仅对正品及混伪品进行鉴定，也能够为物种的分类提供一定信息。

1 材料

1.1 仪器

T100 型PCR 扩增仪[伯乐生命医学产品（上海）有限公司]；DYY-7C 型电泳系统（北京六一生物科技有限公司）；JXFSTPRP-CL 型全自动样品冷冻研磨仪、JS-2000 型紫外凝胶成像仪（上海培清科技有限公司）；QH07058 型微量移液器（赛默飞世尔科技公司）；WZB-32AF/S 型制冰机（宁波惠康国际工业有限公司）；LC-JSY-1 型恒温金属浴、LCMini-12KSP 型离心机（上海力辰仪器科技有限公司）；SPEED×10 型混匀仪（群安实验仪器有限公司）；P70F23P-G5（B0）型微波炉（格兰仕集团）。

1.2 试药

Ezup 柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒（批号：B518251-0301）、GelRed（批号：H902KA1483）、Marker DL 2000（批 号：B500350-0500）、5×TBE buffer（批号：B548102-0500）、双蒸水（批号：A500197-0500）、1×TE buffer（批 号：B548106-0500）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；琼脂糖（批号：1110GR100，德国Biofroxx 公司）；2×TaqMaster Mix（批号：L/N 017E2201CB，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）。

1.3 样品

蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混伪品较多，通过查阅《常用中药材及混伪品种整理》[10]、《中药材市场常见易混品种鉴别图集》[11]、《中国中药材真伪鉴别图典1（常用贵重药材、进口药材分册）》[12]、《实用中药材品种鉴别》[13]、《易混淆中药鉴别》[14]等书籍发现，蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混伪品数量分别有16、19、11种。同时，参考《中国动物志·爬行纲（第三卷）》[15]及在线网站iNaturalistGT（https://guatemala.inaturalist.org/taxa/85553-Serpentes）对各物种的分类学信息进行分析，最终确定各物种拉丁学名并在GenBank下载各物种COⅠ碱基序列。将记载蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇各自对应的混伪品进行统计（表1）。分别从安徽亳州、河北安国、成都荷花池药材市场购买金钱白花蛇、蕲蛇、乌梢蛇及其混伪品，所有样品均经亳州学院孟祥松主任中药师鉴定，存放在亳州学院冷库内，样品信息见表2。

表1 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混伪品

表2 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品

2 方法

2.1 DNA提取

取样品蛇肌肉组织，用75%乙醇擦拭灭菌后用手术剪剪碎，低温冷冻研磨仪研磨，取粉末约20 mg，使用Ezup 柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒提取总DNA，具体操作步骤按试剂盒操作说明进行。

2.2 PCR扩增和电泳条件

扩增的序列的引物为动物COⅠ基因通用引物，正向引物：LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向引物：HCO21985′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR 反应体系为50 μL，体系内含引物对各1.0 μL（10 μmol·L-1），2×TaqMaster Mix 25 μL，模板1 μL，加双蒸水补足至50 μL。扩增程序参考《中国药典》2020年版（四部）[16]，为95 ℃，3 min；94 ℃，40 s，45 ℃，30 s，72 ℃，30 s，30个循环；72 ℃，10 min。4 ℃短期保存，-20 ℃长期保存。

2.3 序列测序及数据处理

取PCR 产物5 μL，用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压为100 V，电泳时间为35 min，Marker 为DL2000，将PCR 产物进行双向测序，得到正、反碱基序列，利用CodonCodeAligner 11.0.1查看峰图并进行双向拼接，去除低质量区及引物区，获得目标碱基序列。从GenBank下载32种蛇类COⅠ基因序列，为保证下载碱基序准确性，所有下载碱基均经Blast 检索和BOLD 平台验证，鉴定率均达到99%以上（表3）。

表3 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品的GenBank登录号

2.4 种间信息位点

利用MEGA 11.0 软件对蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇测序获得的COⅠ基因序列进行比对分析，获得三者的简约信息位点。将实验测得蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇与混伪品种碱基序列和表3 中碱基序列进行比对，分别获得蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇与其各自对应混伪品的简约信息位点。

2.5 种间遗传距离

利用MEGA 11.0 软件将所测物种的COⅠ序列与从GenBank 下载的碱基序列进行遗传距离比对分析，获得各物种种间、种内遗传距离。

2.6 构建NJ系统聚类树

利用MEGA 11.0 软件将所测物种的COⅠ序列与从GenBank 下载的碱基序列构建NJ 系统聚类树，同时以自举检验法（Bootstrap）检验聚类树各分支的支持率，自展次数设置为1000次。

3 结果

3.1 种间信息位点

将测序获得的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇COⅠ基因序列进行比对分析，蕲蛇与乌梢蛇、金钱白花蛇分别有134、135 个信息位点，乌梢蛇与金钱白花蛇有117个信息位点，三者共有189个信息位点；蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇与其对应的混伪品分别有253、265、233 个信息位点，三者种内信息位点分别有27、28、13个。

3.2 遗传距离分析

将测序获得的COⅠ碱基序列与从GenBank下载的碱基序列进行比对分析，由于物种数量较多，表3 的序号对应的物种只展示种间遗传距离及种内平均遗传距离，各物种种间遗传距离均大于0.100，种内遗传距离均小于0.056，蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品物种平均种内、种间遗传距离见增强出版附加材料。

3.3 NJ系统聚类树

将所测样本序列与从GenBank 下载的碱基序列进行比对分析并构建NJ 系统聚类树，如图1 所示，蕲蛇、金钱白花蛇、乌梢蛇均独立聚为一支，三者分别归属于蝰科、眼镜蛇科、游蛇科，与科内其他混伪品种均独立聚为一支，说明基于COⅠ序列不仅能够鉴别蕲蛇、金钱白花蛇、乌梢蛇，还能够鉴别可能科内其他物种。所有的样品均为蝰科、眼镜蛇科、游蛇科科内物种，但基于3 科物种的NJ 系统发育树显示并未聚为三大支，其中游蛇科有14 属21种，科内物种并未聚为一支，华游蛇属（赤链华游蛇、环纹华游蛇）及腹链蛇属（草腹链蛇）与蝰科聚为一大支；林蛇属（黄环林蛇）及颈棱蛇属（颈棱蛇）与眼镜蛇科聚为一大支；水蛇属（宽吻水蛇）、铅色蛇属（铅色水蛇）、沼蛇属（中国沼蛇）、渔游蛇属（渔游蛇）并未与其他游蛇科物种聚为一大支；锦蛇属玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇并未聚为一支，而是玉斑锦蛇与滞卵蛇属聚为一小支，百花锦蛇与黑眉锦蛇并未聚为一小支。

图1 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇NJ系统聚类树

4 讨论

根据NJ系统发育树显示，除沼蛇属中国沼蛇未聚为一支外，其余各物种均独立聚为一支。中国沼蛇种内遗传距离为0.018，而赤链蛇、山烙铁头、王锦蛇、中介蝮种内遗传距离分别为0.022、0.056、0.019、0.018，均不小于0.018 且均聚为一支，这可能是由于中国沼蛇位于聚类树外围导致的。蝰科与游蛇科华游蛇属、腹链蛇属聚为一支，且游蛇科华游蛇属、腹链蛇属与游蛇科其他属相距较远，显示华游蛇属（赤链华游蛇、环纹华游蛇）、腹链蛇属（草腹链蛇）与蝰科更近的亲缘关系。眼镜蛇科与游蛇科（林蛇属、颈棱蛇属）聚为一支并与游蛇科、蝰科并列聚类，显示了林蛇属黄环林蛇、颈棱蛇属颈棱蛇与眼镜蛇科有更近的亲缘关系。眼镜蛇科与蝰科为姐妹群，说明眼镜蛇科与蝰科亲缘关系较近。《中国动物志·爬行纲（第三卷）》将红纹滞卵蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇都归属为锦蛇属[15]，而根据在线网站可知红纹滞卵蛇归属为滞卵蛇属，王锦蛇归属为玉斑蛇属，玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇归为锦蛇属，NJ 系统发育树支持该物种在线网站中的最新归属，但锦蛇属内玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇并未聚为一支。《中国动物志·爬行纲（第三卷）》将乌梢蛇归属为乌梢蛇属，白环蛇归属为白环蛇属，赤链蛇归属为赤链蛇属，黑背白环蛇及双全白环蛇归属为白环蛇属[15]，在线网站将乌梢蛇归属为鼠蛇属，白环蛇、赤链蛇、黑背白环蛇、双全白环蛇归属为白环蛇属，NJ 系统聚类树均支持在线网站中的最新物种归属。

以上说明，基于DNA 条形码COⅠ基因能够对32 种蛇类进行鉴定，赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇归属为蝰科和黄环林蛇、颈棱蛇归属为眼镜蛇科有待进一步研究；锦蛇属玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇归属有待一进步研究；蝰科、眼镜蛇科、游蛇科聚为一大支，与宽吻水蛇、铅色水蛇、中国沼蛇、渔游蛇并列聚类，这4 个物种独立于蝰科、眼镜蛇科、游蛇科，其种属分类有待进一步研究。