APP下载

基于DNA条形码的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及混伪品等32种的鉴别△

2023-09-30王孟虎许亮蒋磊李峰孙一帆康廷国孟祥松张圣阳钟明月黄文康石飘柔

中国现代中药 2023年8期
关键词:乌梢蛇白花蛇伪品

王孟虎,许亮,蒋磊,李峰,孙一帆,康廷国,孟祥松,张圣阳,钟明月,黄文康,石飘柔

1.辽宁中医药大学,辽宁 大连 116600;

2.亳州学院,安徽 亳州 236800;

3.亳州市食品药品检验中心,安徽 亳州 236800;

4.亳州职业技术学院,安徽 亳州 236800;

5.中国药科大学,江苏 南京 210000

蕲蛇(Agkistrodon)为蝰科尖吻蝮属动物五步蛇Agkistrodon acutus(Guenther)的干燥体,乌梢蛇(Zaocys)为游蛇科动物乌梢蛇Zaocys dhumnades(Cantor)的干燥体,金钱白花蛇(Bungarus Parvus)为眼镜蛇科动物银环蛇Bungarus multicinctusBlyth的幼蛇干燥体,具有祛风、通络、止痉的功效,主治风湿顽痹、中风、麻木拘谨、半身不遂等,均收载于《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2020年版[1]。由于野生蛇类资源匮乏,人工养殖规模还未满足需求,导致市售蛇类药材价格较高。市售药材为不完整个体,常常掺杂有混伪品。为了保证用药的安全性、维护蛇类药材市场的稳定性,建立快速、准确鉴别蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其易混伪品的方法具有重要意义。

DNA 条形码由Hebert等[2-3]在2002年提出,陈士林等[4]在此基础上进行了大量研究,确立了动物类药材DNA条形码细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因鉴定体系。由于该方法不受个体、环境等因素影响,能够准确、快速地对物种进行鉴定,现已应用在各动物类样品的鉴定及鉴别领域。晁志等[5]基于DNA条形码COⅠ基因对金钱白花蛇及其8种混伪品进行鉴定,显示各物种均独立聚为一支,其中游蛇科与眼镜蛇科为姐妹群。廖倩等[6]基于DNA 条形码COⅠ基因对23种蛇类进行鉴定,显示各物种均独立聚为一支,游蛇科与眼镜蛇科为姐妹群,链蛇属与白环蛇属亲缘关系较近,并支持前人研究中对锦蛇属的重新划分(玉斑锦蛇被归类于丽蛇属,称为玉斑丽蛇;三索锦蛇被归类为颌腔蛇属,称为三索颌腔蛇;王锦蛇仍归属于锦蛇属)。黄勇等[7]基于DNA条形码COⅠ基因对19 种蛇类进行鉴定,结果显示灰鼠蛇有可能被错误鉴定为乌梢蛇,赤练蛇种内遗传距离差异较大。石林春等[8]基于DNA条形码COⅠ基因对黑眉锦蛇、锦蛇、乌梢蛇蛇蜕进行鉴定,结果显示该方法能够准确鉴定3 种蛇蜕。崔丽娜等[9]基于DNA 条形码COⅠ基因对金钱白花蛇及4 种伪品进行准确鉴定。《中国药典》2020 年版利用性状、特异性引物对蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品进行鉴别,其中设计的特异性引物能够对正品进行扩增并有单一条带,而伪品则无条带[1]。虽然,利用该方法能够准确鉴定蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇,但却无法对混伪品进行鉴定,无法获知混伪品的基原信息。

在前人研究的基础上,本课题组收集蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品,结合从GenBank 下载的正品及混伪品COⅠ序列构建邻接(NJ)系统发育树,不仅对正品及混伪品进行鉴定,也能够为物种的分类提供一定信息。

1 材料

1.1 仪器

T100 型PCR 扩增仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司];DYY-7C 型电泳系统(北京六一生物科技有限公司);JXFSTPRP-CL 型全自动样品冷冻研磨仪、JS-2000 型紫外凝胶成像仪(上海培清科技有限公司);QH07058 型微量移液器(赛默飞世尔科技公司);WZB-32AF/S 型制冰机(宁波惠康国际工业有限公司);LC-JSY-1 型恒温金属浴、LCMini-12KSP 型离心机(上海力辰仪器科技有限公司);SPEED×10 型混匀仪(群安实验仪器有限公司);P70F23P-G5(B0)型微波炉(格兰仕集团)。

1.2 试药

Ezup 柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒(批号:B518251-0301)、GelRed(批号:H902KA1483)、Marker DL 2000(批 号:B500350-0500)、5×TBE buffer(批号:B548102-0500)、双蒸水(批号:A500197-0500)、1×TE buffer(批 号:B548106-0500)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;琼脂糖(批号:1110GR100,德国Biofroxx 公司);2×TaqMaster Mix(批号:L/N 017E2201CB,南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。

1.3 样品

蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混伪品较多,通过查阅《常用中药材及混伪品种整理》[10]、《中药材市场常见易混品种鉴别图集》[11]、《中国中药材真伪鉴别图典1(常用贵重药材、进口药材分册)》[12]、《实用中药材品种鉴别》[13]、《易混淆中药鉴别》[14]等书籍发现,蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混伪品数量分别有16、19、11种。同时,参考《中国动物志·爬行纲(第三卷)》[15]及在线网站iNaturalistGT(https://guatemala.inaturalist.org/taxa/85553-Serpentes)对各物种的分类学信息进行分析,最终确定各物种拉丁学名并在GenBank下载各物种COⅠ碱基序列。将记载蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇各自对应的混伪品进行统计(表1)。分别从安徽亳州、河北安国、成都荷花池药材市场购买金钱白花蛇、蕲蛇、乌梢蛇及其混伪品,所有样品均经亳州学院孟祥松主任中药师鉴定,存放在亳州学院冷库内,样品信息见表2。

表1 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇的混伪品

表2 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品

2 方法

2.1 DNA提取

取样品蛇肌肉组织,用75%乙醇擦拭灭菌后用手术剪剪碎,低温冷冻研磨仪研磨,取粉末约20 mg,使用Ezup 柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒提取总DNA,具体操作步骤按试剂盒操作说明进行。

2.2 PCR扩增和电泳条件

扩增的序列的引物为动物COⅠ基因通用引物,正向引物:LCO1490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′,反向引物:HCO21985′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR 反应体系为50 μL,体系内含引物对各1.0 μL(10 μmol·L-1),2×TaqMaster Mix 25 μL,模板1 μL,加双蒸水补足至50 μL。扩增程序参考《中国药典》2020年版(四部)[16],为95 ℃,3 min;94 ℃,40 s,45 ℃,30 s,72 ℃,30 s,30个循环;72 ℃,10 min。4 ℃短期保存,-20 ℃长期保存。

2.3 序列测序及数据处理

取PCR 产物5 μL,用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳,电泳电压为100 V,电泳时间为35 min,Marker 为DL2000,将PCR 产物进行双向测序,得到正、反碱基序列,利用CodonCodeAligner 11.0.1查看峰图并进行双向拼接,去除低质量区及引物区,获得目标碱基序列。从GenBank下载32种蛇类COⅠ基因序列,为保证下载碱基序准确性,所有下载碱基均经Blast 检索和BOLD 平台验证,鉴定率均达到99%以上(表3)。

表3 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品的GenBank登录号

2.4 种间信息位点

利用MEGA 11.0 软件对蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇测序获得的COⅠ基因序列进行比对分析,获得三者的简约信息位点。将实验测得蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇与混伪品种碱基序列和表3 中碱基序列进行比对,分别获得蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇与其各自对应混伪品的简约信息位点。

2.5 种间遗传距离

利用MEGA 11.0 软件将所测物种的COⅠ序列与从GenBank 下载的碱基序列进行遗传距离比对分析,获得各物种种间、种内遗传距离。

2.6 构建NJ系统聚类树

利用MEGA 11.0 软件将所测物种的COⅠ序列与从GenBank 下载的碱基序列构建NJ 系统聚类树,同时以自举检验法(Bootstrap)检验聚类树各分支的支持率,自展次数设置为1000次。

3 结果

3.1 种间信息位点

将测序获得的蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇COⅠ基因序列进行比对分析,蕲蛇与乌梢蛇、金钱白花蛇分别有134、135 个信息位点,乌梢蛇与金钱白花蛇有117个信息位点,三者共有189个信息位点;蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇与其对应的混伪品分别有253、265、233 个信息位点,三者种内信息位点分别有27、28、13个。

3.2 遗传距离分析

将测序获得的COⅠ碱基序列与从GenBank下载的碱基序列进行比对分析,由于物种数量较多,表3 的序号对应的物种只展示种间遗传距离及种内平均遗传距离,各物种种间遗传距离均大于0.100,种内遗传距离均小于0.056,蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇及其混伪品物种平均种内、种间遗传距离见增强出版附加材料。

3.3 NJ系统聚类树

将所测样本序列与从GenBank 下载的碱基序列进行比对分析并构建NJ 系统聚类树,如图1 所示,蕲蛇、金钱白花蛇、乌梢蛇均独立聚为一支,三者分别归属于蝰科、眼镜蛇科、游蛇科,与科内其他混伪品种均独立聚为一支,说明基于COⅠ序列不仅能够鉴别蕲蛇、金钱白花蛇、乌梢蛇,还能够鉴别可能科内其他物种。所有的样品均为蝰科、眼镜蛇科、游蛇科科内物种,但基于3 科物种的NJ 系统发育树显示并未聚为三大支,其中游蛇科有14 属21种,科内物种并未聚为一支,华游蛇属(赤链华游蛇、环纹华游蛇)及腹链蛇属(草腹链蛇)与蝰科聚为一大支;林蛇属(黄环林蛇)及颈棱蛇属(颈棱蛇)与眼镜蛇科聚为一大支;水蛇属(宽吻水蛇)、铅色蛇属(铅色水蛇)、沼蛇属(中国沼蛇)、渔游蛇属(渔游蛇)并未与其他游蛇科物种聚为一大支;锦蛇属玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇并未聚为一支,而是玉斑锦蛇与滞卵蛇属聚为一小支,百花锦蛇与黑眉锦蛇并未聚为一小支。

图1 蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇NJ系统聚类树

4 讨论

根据NJ系统发育树显示,除沼蛇属中国沼蛇未聚为一支外,其余各物种均独立聚为一支。中国沼蛇种内遗传距离为0.018,而赤链蛇、山烙铁头、王锦蛇、中介蝮种内遗传距离分别为0.022、0.056、0.019、0.018,均不小于0.018 且均聚为一支,这可能是由于中国沼蛇位于聚类树外围导致的。蝰科与游蛇科华游蛇属、腹链蛇属聚为一支,且游蛇科华游蛇属、腹链蛇属与游蛇科其他属相距较远,显示华游蛇属(赤链华游蛇、环纹华游蛇)、腹链蛇属(草腹链蛇)与蝰科更近的亲缘关系。眼镜蛇科与游蛇科(林蛇属、颈棱蛇属)聚为一支并与游蛇科、蝰科并列聚类,显示了林蛇属黄环林蛇、颈棱蛇属颈棱蛇与眼镜蛇科有更近的亲缘关系。眼镜蛇科与蝰科为姐妹群,说明眼镜蛇科与蝰科亲缘关系较近。《中国动物志·爬行纲(第三卷)》将红纹滞卵蛇、玉斑锦蛇、王锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇都归属为锦蛇属[15],而根据在线网站可知红纹滞卵蛇归属为滞卵蛇属,王锦蛇归属为玉斑蛇属,玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇归为锦蛇属,NJ 系统发育树支持该物种在线网站中的最新归属,但锦蛇属内玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇并未聚为一支。《中国动物志·爬行纲(第三卷)》将乌梢蛇归属为乌梢蛇属,白环蛇归属为白环蛇属,赤链蛇归属为赤链蛇属,黑背白环蛇及双全白环蛇归属为白环蛇属[15],在线网站将乌梢蛇归属为鼠蛇属,白环蛇、赤链蛇、黑背白环蛇、双全白环蛇归属为白环蛇属,NJ 系统聚类树均支持在线网站中的最新物种归属。

以上说明,基于DNA 条形码COⅠ基因能够对32 种蛇类进行鉴定,赤链华游蛇、环纹华游蛇、草腹链蛇归属为蝰科和黄环林蛇、颈棱蛇归属为眼镜蛇科有待进一步研究;锦蛇属玉斑锦蛇、百花锦蛇、黑眉锦蛇归属有待一进步研究;蝰科、眼镜蛇科、游蛇科聚为一大支,与宽吻水蛇、铅色水蛇、中国沼蛇、渔游蛇并列聚类,这4 个物种独立于蝰科、眼镜蛇科、游蛇科,其种属分类有待进一步研究。

猜你喜欢

乌梢蛇白花蛇伪品
冬冲夏草与掺伪品的鉴别研究
乌梢蛇PCR快检试剂盒的应用与评价
白花蛇舌草茶饮料的研究与展望
乌梢蛇的本草考证研究△
基于网络药理学探讨白花蛇舌草主要成分的抗癌机制
白花蛇舌草化学成分及其抗肿瘤活性
近红外光谱技术鉴别白及粉及其混伪品
电子舌技术鉴别川贝母粉及其掺伪品
应用rbcL条形码鉴别高良姜及其伪品大高良姜
白花蛇舌草及其混淆品中5种抗肿瘤核苷类成分含量测定