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miRNA-21的循环放大检测及成像

2023-09-29孙鑫鑫李家家丁彩凤

关键词:抗污染泳道亲水性

孙鑫鑫, 李家家, 丁彩凤

(青岛科技大学 化学与分子工程学院, 山东 青岛 266042)

众所周知,miRNA 是一类非编码单链RNA,长度约为18~22 个核苷酸[1]。miRNA 的类型有很多,比如miRNA-21[1-2]、miRNA-30b[3]、miRNA-122[4]等。有很多研究报道,单个的miRNA 具有调节和抑制癌基因表达能力,miRNA 的部分缺失还会导致癌症的发生[5]。因此,越来越多的学者对于miRNA 进行了相关的实验研究与理论探讨,期望通过对miRNA 的研究实现对人体癌症的早起诊断与预防[6]。

纳米材料碳量子点,在2004年被首次发现[7],它类似球形,其直径小于10 nm,通常包括C、H、O、N 4种基本元素[8-9],其表面含有氨基、羧基、羟基等官能团[10]。CDs具有普通纳米材料没有的荧光性能,可以用于构建荧光探针。同时,CDs的毒性更低、亲水性更好、光稳定性更好,使得CDs可用于细胞成像,且红色发射的CDs使得具有更高的成像深度,具有一定的体内检测优势[11]。

聚多巴胺纳米球(PDANSs)也是当前备受关注的新型仿生材料,主要是多巴胺 (DA) 在水溶液中通过自身的氧化-聚合形成的[12]。不仅可以用作生物相容的荧光传感器和生物成像[13],而且还可以通过能量转移或电子转移过程对邻近的荧光团产生显著的荧光猝灭效应[14]。将多种多功能纳米材料进行联合使用,更有助于提高对肿瘤标志物的检测效率,对于癌症的早起诊断与预防具有深远意义。

本研究通过合成两种多功能纳米材料,进而组装成为纳米探针,实现对肿瘤标志物miRNA-21的相关检测及细胞成像。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高压釜,FCF-0.5型,郑州科达机械仪器设备有限公司;0.22μm 的微孔滤膜过滤器,河南泰斯特仪器有限公司;透射电子显微镜,JEM-F200 型,日本电子株式会社;扫描电子显微镜,Regulus 8100型,锐力科技股份有限公司;紫外可见分光光度计,UH5300型,日本日立高新技术公司;荧光分光光度计,F-4600型,日本日立高新技术公司;激光粒度分布仪,WT NanoZs型,英国马尔文仪器有限公司。

柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2 H2O)、盐酸多巴胺(C8H12Cl NO2)、无水乙醇(C2H6O)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、异丙醇(C3H8O)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)。DNA、miRNA 及多肽具体序列见表1所示。新鲜菠菜购自本地超市。

表1 DNA、miRNA和多肽的序列信息Table 1 Sequence information of DNA,miRNA and polypeptide

1.2 实验过程

1.2.1 红色发射CDs的合成及表征

以新鲜菠菜叶为碳源,合成了具有红色发射的CDs。取0.5 g去除茎脉的新鲜菠菜叶,加入5 m L 0.1 g·mL-1的柠檬酸钠溶液,20 mL无水乙醇,水热法150℃反应12 h后经0.22μm滤膜过滤,再经透析、纯化、冷冻干燥一系列过程,最终得到固体CDs。

1.2.2 PDANSs的合成及表征

100 m L Tris缓冲液(10 mmol·L-1)和40 m L异丙醇的混合物中加入0.1 g盐酸多巴胺,在黑暗中连续搅拌12 h,最终得到的溶液进行离心,水洗重复3次,最后对沉淀进行干燥后重新分散,之后进行PDANSs的SEM、TEM、FT-IR、紫外、Raman、抗污染等一系列表征。

1.2.3 纳米探针的自组装过程

等物质的量zyme链与sub链淬火(95℃加热5 min,之后缓慢降至室温)后与CDs及连接抗污染多肽的PDANSs进行混合,然后加入适量的DMAP(0.1 mmol·L-1)作为高效的酰化反应催化剂用于氨基与羧基的连接,静止12 h后离心去除未连接的DNA zyme、CDs、PDANSs及偶联剂。

1.2.4 miRNA-21的检测与细胞成像

将自组装的纳米探针与靶标miRNA-21 及Mg2+体外反应一段时间后,分别测不同浓度、不同时间下的荧光强度变化,之后进行细胞成像。

1.3 实验原理

体内外检测过程原理见图1,首先合成了CDs和PDANSs两种纳米材料,其中PDANSs既可以作为CDs的荧光猝灭剂,又可作为材料载体,保证纳米复合材料可以顺利进入到细胞中。同时表面连接的抗污染多肽,可以提高纳米材料在检测过程的抗污染效果,避免受到其他蛋白的干扰,影响实验测定。CDs与PDANSs、DNA 通过酰胺键进行连接,此时CDs与TAMRA-N 的荧光通过荧光共振能量转移分别被PDANSs及BHQ 2猝灭,并无荧光信号。在miRNA-21 存在的情况下,DNA sub 链与miRNA-21链进行配对的碱基数更多、结合力更强,可实现与miRNA-21 链的特异性结合,导致DNA sub-zyme链解离,实现CDs 650 nm 发射处的红色荧光恢复。游离的DNA zyme链会在Mg2+存在的条件下实现对DNA sub 链的特异性切割,导致TAMRA-N 580 nm 处的橙色荧光恢复。之后DNA zyme链进一步进行游离,实现另外DNA sub链的切割,从而达到信号检测的循环放大效果,提高检测的灵敏度,而且双荧光检测可以提高检测结果的准确性。

2 结果与讨论

2.1 CDs的相关表征

2.1.1 CDs的形貌及拉曼表征

通过水热法合成了具有红色发射的CDs,并对其进行了形貌、粒径、电位、官能团等一系列表征,见图2~图5。

图2 CDs的TEM 照片Fig.2 TEM images of CDs

以菠菜叶、乙醇、柠檬酸钠为原料,合成了CDs。图2为CDs 在不同标尺下的透射电子显微镜(TEM)图像。由图2可以看出,所制备的纳米材料CDs为分散均匀的球形结构,粒径在2~7 nm。插图为CDs的高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)。可以看出,所制备的CDs具有分辨率良好的晶格条纹,平面间距为0.23 nm。图3为CDs的动态光散射水合半径分布图。结果显示粒度分布主要集中在10 nm 左右的范围内,相比较干燥后的样品所进行的透射电镜成像来说,水合粒径因其表面电荷对溶液中H+、OH-的吸附,使得所测得的粒径结果较透射电镜显示的粒子半径大些。

图3 CDs的DLS粒度表征Fig.3 Size distribution of CDs

然后对CDs的合成进行了拉曼光谱表征,以验证CDs的成功制备见图4。如图4所示,在1 369,1 563 cm-1处显示出了CDs的典型拉曼峰,其中1 369 cm-1属于D 带,归因于无定形碳,表示C 原子的晶格缺陷,而1 563 cm-1属于G 带,归因于石墨碳,表示C 原子sp2杂化的面内伸缩振动。图4拉曼光谱显示了CDs在D 带与G 带的典型拉曼峰,表明了所制备的CDs含有两种类型的碳物种,证明了CDs的成功合成。

图4 CDs的Raman光谱表征Fig.4 Raman images of CDs

2.1.2 CDs的红外光谱表征

利用红外光谱对CDs的化学组成和成键进行了进一步的表征,见图5。

图5 CDs的红外光谱表征Fig.5 FT-IR spectrum of CDs

从图5可以看出CDs的主要成键组成,其表面含有多种官能团。其中,在3 427 cm-1的吸收带对应于N—H 的伸缩振动,2 975,2 925,2 865 和1 460 cm-1处比较宽的吸收带归因于CH、CH2、CH3的伸缩和弯曲振动,1 616 cm-1处比较尖锐的吸收带被指定为的伸缩振动,而1 386,1 375 cm-1处的宽吸收带及1 227 cm-1处的吸收带归因于C—N 的伸缩振动,1 080 cm-1处的吸收带是由C—O—C 的伸缩振动引起的。以上的红外数据表明,CDs表面含有大量的氨基,便于后面对纳米材料进行表面修饰。

2.1.3 CDs的相对荧光量子产率测定

对于CDs的相对荧光量子产率进行了测定与计算,选择以硫酸奎宁为标准,通过测定硫酸奎宁与CDs的荧光与紫外吸收,对CDs的相对荧光量子产率进行计算。硫酸奎宁的紫外吸收光谱和荧光光谱见图6和图7。CDs的紫外吸收光谱和CDs的荧光光谱见图8和图9。

图6 硫酸奎宁的紫外吸收光谱Fig.6 Ultraviolet absorption spectrum of quinine sulfate

图7 硫酸奎宁的荧光光谱Fig.7 Fluorescence spectrum of quinine sulfate

图8 CDs的紫外吸收光谱Fig.8 Ultraviolet absorption spectrum of CDs

图9 CDs的荧光光谱Fig.9 Fluorescence spectrum of CDs

通过公式Yu=Ys×Fu/Fs×As/Au计算出,CDs红色发射的相对荧光量子产率为13.3%。

2.2 PDANSs的相关表征

2.2.1 PDANSs的形貌表征

以盐酸多巴胺为原料进行PDANSs的制备,然后对其进行了材料表征。

图10 为PDANSs 的TEM 照片。图11 为PDANSs的SEM 照片。由图10、图11两图可以看出,制备的PDANSs纳米材料的粒径在200 nm 左右。而图12的动态光散射粒度分布直方图的数据也可以更加直观地说明,所制备的纳米材料PDANSs的平均粒径在200 nm 左右。

图10 PDANSs的TEM 照片Fig.10 TEM image of PDANSs

图11 PDANSs的SEM 照片Fig.11 SEM image of PDANSs

图12 PDANSs的DLS粒径表征Fig.12 Size distribution of PDANSs

2.2.2 PDANSs的紫外及荧光表征

根据本课题设计原理,需要PDANSs具有比较宽泛的紫外吸收,从而达到可以猝灭CDs荧光的效果。

图13为PDANSs的紫外吸收光谱。

图13 PDANSs的紫外吸收光谱Fig.13 UV-Vis absorption spectrum of PDANSs

由图13 可以发现,PDANSs的紫外吸收光谱与所预想的相一致,具有比较宽的紫外吸收,可以实现对CDs 的荧光猝灭。不同浓度的PDANSs 对CDs的荧光猝灭效果见图14。可以看出,PDANSs对CDs的荧光猝灭效果比较明显。

图14 PDANSs对CDs的荧光猝灭效果Fig.14 Fluorescence quenching effect of PDANSs on CDs

2.2.3 PDANSs的拉曼及红外光谱表征

通过拉曼及红外光谱对PDANSs进行了表征,来验证PDANSs的成功合成。

图15为DA、PDANSs的拉曼光谱表征,与单体多巴胺相比较,PDANSs在1 400、1 550 cm-1处出现了明显的拉曼特征峰,证明了PDANSs的成功合成。同时从(图16)DA、PDANSs的红外光谱可以看出,单体多巴胺在500~1 700 cm-1处有很多密集的峰,但聚合成PDANSs后该范围的峰几乎消失,证明了PDANSs的成功合成。

图15 DA与PDANSs的拉曼光谱表征Fig.15 Raman spectroscopic characterization of DA and PDANSs

图16 DA与PDANSs的红外光谱表征Fig.16 FT-IR spectrum of DA and PDANSs

2.3 复合纳米探针的构建及表征

2.3.1 DNA 组装结构软件模拟及电泳表征

对组装的DNA 结构进行了软件模拟,如图17所示。在对制备的CDs和PDANSs进行各种表征后,将两种纳米材料与设计的DNA 链进行了整体连接,然后对构建成功的纳米探针进行了凝胶电泳表征,见图18。

图17 DNA zyme结构图Fig.17 Structure diagram of DNA zyme

图18 DNA zyme的凝胶电泳图Fig.18 Gel electrophoresis diagram of DNA zyme

图18 中,泳道a 为DNA marker,泳道b 为miRNA-21,泳道c为zyme链,泳道d为sub链,泳道e为zyme+sub,泳道f为zyme+sub+miRNA-21+Mg2+。从图18看出,泳道b、c、d 3条单链条带清晰,不含杂质;泳道e是zyme链和sub链的结合,条带明显上移;泳道f是加入miRNA-21 和Mg2+后组装的DNA 结构被切割,条带实现分离,证明了在本次实验中DNA结构的成功构建与切割。

2.3.2 复合纳米探针的抗污染效果及亲水性测定

PDANSs的表面黏着性较高,容易吸附一些其他干扰物质,影响miRNA-21 的测定。基于此,设计在PDANSs表面连接一段抗污染多肽,用来提高PDANSs的抗污染性能。

图19是通过PDANSs包裹多肽前后对于修饰FITC的BSA 的吸附能力进行验证,来证明包裹多肽后的PDANSs的抗污染效果。

图19 PDANSs包裹多肽前后的抗污染效果Fig.19 Anti-pollution effect of PDANSs before and after wrapping polypeptide

由图19可以看出,在未包裹多肽时,随着混合时间的延长,BSA 被吸附的量增多,则上清液的荧光降低;而包裹多肽后与修饰FITC 的BSA 进行混合后发现,混合相同的时间,上清液的荧光明显增强,这说明包裹多肽后的PDANSs对BSA 的吸附量是明显低于包裹多肽前的。证明了包裹多肽对于PDANSs是有一定的抗污染效果的。

之后对于材料的构建进行了亲水性验证实验,如图20所示。图20(a)为二次水空白对照,接触角为58.33°,图20(b)为PDANSs,表面含有丰富的官能团导致亲水性较好,接触角较小,为36.16°,图20(c)为PDANSs包裹一层多肽,因为多肽具有良好的亲水性,导致接触角进一步减小至18.33°,图20(d)为纳米材料与DNA 连接后的接触角,DNA 良好的亲水性导致接触角很小,低至9.90°,图20(e)是指包裹多肽后的纳米材料与DNA 连接后的接触角测定,由于多肽与DNA 本身的亲水特性,导致接触角进一步减小至8.34°。由此可见,该纳米探针的亲水性非常好,表明具有良好的抗污染效果。

图20 复合纳米材料的亲水性测定Fig.20 Contact angles images of different samples

2.3.3 miRNA-21的体外检测

2.3.3.1 时间优化

为了验证实验设计合成的纳米探针对于癌细胞中标志物miRNA-21的响应能力,首先在体外分别对不同反应时间及不同浓度的miRNA-21 进行了荧光强度的测定。

图21 所示为反应时间与CDs及TAMRA-N的荧光强度关系, 而图22是其更直观的线性关系。从中可以看出,随着反应时间的不断增加,其荧光强度刚开始迅速增强,随后增强速度减缓,之后在50 min左右可以达到荧光强度比较稳定的状态,所以最终选择50 min作为最佳反应时间。

2.3.3.2 工作曲线

以50 min作为最佳反应时间,对不同浓度的miRNA-21进行了荧光强度测定,见图23。

图23 miRNA检测的荧光恢复曲线Fig.23 Optimization of reaction time for miRNA detection

由图23可以发现,随着miRNA-21 浓度的不断增加,CDs及TAMRA-N 的荧光逐渐恢复,且呈现良好的线性相关性,见图24,线性相关系数R2为0.995,计算的最低检测限达30 pmol·L-1,远低于大部分报道的miRNA-21检测限,说明此次设计合成的纳米探针对于癌细胞标志物miRNA-21 的检测是十分灵敏和有效的。

图24 以585nm 处的荧光值为纵坐标,浓度的对数为横坐标绘制散点图及其拟合曲线(其中线性相关系数R 2=0.995)Fig.24 Draw a scatter plot with the fluorescence at 585 nm as the ordinate and the logarithm of the concentration as the abscissa.(And draw a fitting curve(the linear correlation coefficient R 2=0.995)

2.3.3.3 选择性测定

与此同时,还选择了miRNA-21 的同源性miRNA 进行选择性实验,见图25。

图25 miRNA检测的选择性优化Fig.25 Selective optimization of miRNA detection

如图25所示,发现本次实验设计合成的纳米探针对于其余的同源性miRNA 并没有明显的荧光响应,证明该纳米探针对于miRNA-21的检测具有良好的特异性,可以用于癌细胞中miRNA-21的检测。

2.3.4 miRNA-21检测的细胞成像实验

2.3.4.1 细胞毒性

该纳米探针在体外对miRNA-21 优异的检测性能促使进行细胞内miRNA-21 成像。首先选择了miRNA-21高表达的Hep G2细胞对其进行了细胞毒性验证,发现无论是CDs、PDANSs、纳米探针还是在不同浓度、不同时间条件下进行的细胞实验,均没有发现明显的细胞毒性(图26~图28)。

图26 纳米材料对细胞活力的影响Fig.26 Cell viabilities of different nanomaterials

图27 不同浓度纳米探针对细胞活力的影响Fig.27 Cell viabilities of different concentrations of composite nanoprobes

图28 纳米探针孵育时间对细胞活力的影响Fig.28 Cell viabilities of different nanoprobes incubated for different times

2.3.4.2 复合纳米探针浓度及细胞孵育时间条件优化

验证纳米探针对Hep G2细胞存活率没有明显影响后,对其进行了细胞成像实验,见图29。

图29 关于浓度筛选的细胞成像Fig.29 Cell imaging for concentration screening

首先图29中对细胞成像所用的纳米探针浓度进行了筛选,发现在20μg·m L-1时可以达到比较稳定的荧光强度。

接下来以20μg·m L-1纳米探针进行了时间优化成像,发现随着孵育时间的延长,其荧光强度逐渐增强,在与细胞共同孵育6 h后可以达到比较稳定的成像状态(图30)。

图30 细胞内纳米探针孵育不同时间的荧光成像Fig.30 Verification of intracellular double fluorescence imaging

2.3.4.3 细胞内双荧光成像验证

基于本实验涉及到双荧光检测,以20μg·m L-1纳米探针与细胞共孵育6 h后,对于两个不同通道的荧光同时进行了细胞成像,见图31。

图31 细胞内双荧光成像验证Fig.31 Fluorescence imaging of intracellular nanoprobe incubated for different times

如图31所示,可以发现在410 nm 及543 nm通道的激光照射下,纳米探针与细胞共孵育后会发现明显的红色、橙色双通道荧光成像,说明双通道荧光可同时用于癌细胞的miRNA-21检测成像。

2.3.4.4 加入模拟物与抑制剂后的成像实验

图32验证了在加入抑制剂与模拟物后的细胞成像效果,加入抑制剂后荧光信号明显减弱,而加入模拟物后荧光信号明显增强,说明该系统可以成功地用于检测预刺激后miRNA 表达水平的波动。

图32 分别加入模拟物和抑制剂的细胞成像Fig.32 Cell imaging with mimics and inhibitor respectively

4 结 语

为进一步帮助解决癌症标志物miRNA-21 的检测灵敏度与准确性这一难题,本课题组设计了这样一种循环放大检测纳米系统。将两种具有良好生物相容性及低细胞毒性的纳米材料CDs、PDANSs与DNA 进行组装,形成对miRNA-21具有特异性检测的纳米探针。该纳米探针不仅具有双荧光检测信号,而且具有循环放大功能,大大降低检测限,且对其它同源性miRNA 并无明显响应,可实现靶标miRNA-21的循环放大检测,进而大大提高检测的灵敏度及准确性。而且CDs的红色发射具有更高的成像深度,使其具有一定的体内检测优势。PDANSs表面连接的多肽既提高了纳米探针的亲水性,又大大减少了其他蛋白的干扰,具有良好的抗污染特性。该纳米探针优异的检测性能对于miRNA 的功能进行深入研究具有重要意义,而且有望扩展到其他生物分子的放大检测,对于早起癌症的诊断与预防具有深远影响。

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